【摘要】：魚腥草揮發(fā)油(Houttuynia cordata Thunb volatile oil,HCO)是魚腥草的主要藥效組分。預實驗得出HCO具有顯著抑制MCF-7乳腺癌細胞增殖的作用,在此基礎(chǔ)上,本課題進一步研究HCO對MCF-7細胞的體外藥效學、HCO對MCF-7細胞Bcl-2蛋白表達量的影響、體內(nèi)藥效學,且對HCO膠束的制備與評價及其大鼠體內(nèi)藥代動力學進行研究。為HCO作為抗乳腺癌新藥提供科學依據(jù)。1.HCO誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡初步研究MTT法測定HCO對MCF-7細胞的抑制增殖率。作用24 h后,0.40μL/mL的HCO抑制率達70.78%,IC_(50)值為0.284μL/mL。作用48 h后,0.40μL/mL的HCO抑制率達88.30%,IC_(50)為0.236μL/mL。作用72 h后,0.40μL/mL的HCO抑制率達95.21%,IC_(50)為0.217μL/mL。結(jié)果表明:HCO具有顯著抑制MCF-7細胞增殖的作用。PI單染檢測給藥后對MCF-7細胞細胞周期的影響。給藥48 h后,與正常細胞相比,S期細胞數(shù)目增多。隨著HCO濃度的增加,S期細胞數(shù)目呈現(xiàn)增加趨勢。結(jié)果表明:HCO將細胞阻滯在S期。FITC-Annerxin V/PI雙染法檢測細胞給藥后細胞的凋亡狀況。給藥48 h后,在0.25μL/mL以前,隨著HCO濃度的增加,早期凋亡率和總凋亡率增加。壞死率在0.3μL/mL時呈現(xiàn)劇增的趨勢。結(jié)果表明:HCO具有促使MCF-7細胞凋亡的作用。普通倒置顯微鏡下觀察不同濃度的HCO對MCF-7細胞的凋亡狀況。給藥48 h后,普通倒置顯微鏡下觀察細胞明顯皺縮、變圓、核仁破碎,細胞之間的連接中斷,細胞脫落。隨著藥物濃度加大,細胞增殖減少甚至死亡。結(jié)果表明:HCO具有抑制MCF-7細胞增殖促使凋亡的作用。2.HCO對MCF-7細胞Bcl-2蛋白表達量的影響Western Blot實驗測定HCO對MCF-7細胞Bcl-2蛋白表達量的影響。給藥24 h后,收集細胞總蛋白,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,MCF-7細胞中Bcl-2蛋白表達量減少。結(jié)果表明:HCO導致MCF-7細胞中Bcl-2蛋白表達量下調(diào)。3.HCO體內(nèi)抗乳腺癌藥效學研究建立荷乳腺癌小鼠動物模型,研究HCO體內(nèi)藥效。將荷瘤小鼠模型隨機分組給藥,設置組別分別為生理鹽水組、順鉑組(1 mg/kg)、HCO組。HCO給藥劑量分別設定為80 mg/kg、160 mg/kg、240 mg/kg。給藥方式為腹腔注射。HCO給藥劑量為240 mg/kg時,抑瘤率最高為62.16%,順鉑(1 mg/kg)抑瘤率為55.40%。80 mg/kg、160 mg/kg的HCO抑瘤率分別為27.03%、39.19%。順鉑組的小鼠體重下降1 g左右,HCO組的小鼠體重基本不變。HE染色得出,隨著HCO濃度的增加,腫瘤組織壞死面積增加,呈現(xiàn)出量效關(guān)系。對其它臟器沒有較大的副作用。試驗結(jié)果表明:HCO對接種MCF-7細胞荷瘤小鼠的腫瘤生長具有一定的抑制作用。4.HCO膠束的制備與評價采用薄膜分散法制備HCO膠束。單因素考察制備處方和工藝因素,minitab17軟件進行三因素三水平的Box-Behnken設計響應面法優(yōu)化膠束的制備方法。最優(yōu)條件制備的HCO膠束進行形態(tài)特征觀察、釋放度試驗、影響因素試驗、穩(wěn)定性考察。HCO/泊洛沙姆407為1:3、有機溶劑的體積為5 mL、水化體積為5.4 mL時,HCO膠束的包封率可達到87.26%,RSD值為1.79%,粒徑大小為35.20 nm,PDI為0.158。在透射電鏡下,HCO膠束呈球狀,無粘連。在相同的時間段內(nèi),HCO膠束累積釋放量低于直接溶解法制備的膠束。在室溫條件下,HCO膠束放置90 d較穩(wěn)定。試驗結(jié)果表明:最優(yōu)條件制備的HCO膠束具有緩慢釋放的作用,HCO膠束的最優(yōu)儲存條件為室溫、避光、密封保存。5.HCO與HCO膠束的體內(nèi)藥物動力學研究HCO與HCO膠束灌胃給藥,在特定的時間段內(nèi)眼眶取血,DAS 2.0軟件求出各個參數(shù)。HCO膠束的最大血藥濃度為4.85μg/mL,HCO原料藥的最大血藥濃度為5.00μg/mL。HCO膠束達峰時間為4 h,HCO原料藥達峰時間為2 h。HCO膠束的半衰期比HCO原料藥的半衰期延長。試驗結(jié)果表明:HCO膠束提高了藥物生物利用度。綜上研究結(jié)果,HCO具有抑制MCF-7乳腺癌細胞增殖的作用;HCO導致MCF-7細胞凋亡可能與Bcl-2蛋白表達量下調(diào)有關(guān);HCO對荷MCF-7乳腺癌小鼠的腫瘤生長具有抑制作用;制備的HCO膠束具有較高的包封率,增加了其溶解性,提高了藥物生物利用度。本課題為HCO抗乳腺癌進一步研究提供有效的參考。
【圖文】：

13圖 2.1 HCO 對 MCF-7 細胞增殖抑制率Fig.2.1 Proliferation inhibition rate of HCO on MCF-7 cells(a) 24 h 增殖抑制率、(b) 48 h 增殖抑制率、(c) 72 h 增殖抑制率與順鉑組比較*P<0.05，**P<0.01

第二章 HCO 誘導 MCF-7 乳腺癌細胞凋亡初步研究由上述實驗結(jié)果看出，給藥 24 h、48 h、72 h 的抑制率最高分別達 70.78 %、88.30 %、95.21 %。24 h 時的 IC50值為 0.284 μL/mL；48 h 時的 IC50值為 0.236μL/mL；72 h 時的 IC50值為 0.217 μL/mL。給藥濃度相同，隨著給藥時間的延長，抑制率相應增加。給藥時間相同，隨 HCO 濃度的增加，，抑制率相應增加。24 h時，0.20 μL/mL HCO 對細胞的抑制率與 10 μg/mL 的順鉑相當（P>0.05）；48 h、72 h 時，0.35 μL/mL HCO 對細胞的抑制率與 10 μg/mL 的順鉑相當（P>0.05）。3.2 PI 單染檢測細胞周期流式細胞術(shù)檢測得到的 HCO 誘導 MCF-7 細胞周期分布情況，結(jié)果如下：
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R283.6

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本文編號：2627441