【摘要】：目的:肺纖維化(PF)是間質(zhì)性肺疾病的共同病理結(jié)局,是以肺泡壁病變?yōu)橹?涉及周圍組織及相鄰結(jié)構(gòu)的一組非感染性疾病群。其發(fā)病率高,死亡率大,病程一般呈進(jìn)行性發(fā)展,目前尚缺乏確切有效的臨床治療藥物�，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化/抗氧化失衡是促使肺纖維化形成及進(jìn)展的關(guān)鍵。Notch1信號(hào)通路參與了肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展,阻斷這一通路可減少肌成纖維細(xì)胞的生成,抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),從而延緩肺纖維化的進(jìn)展。該實(shí)驗(yàn)通過人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)氧化損傷造模后給予不同濃度丹酚酸A干預(yù),觀察丹酚酸A對(duì)MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用;干預(yù)Notch1信號(hào)通路,觀察丹酚酸A對(duì)MRC-5細(xì)胞氧化/抗氧化失衡機(jī)制的調(diào)節(jié)。方法:首先建立H_2O_2誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞氧化損傷模型,選取分別濃度為200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L的H_2O_2,分別孵育6h、12h、24h,MTT法檢測(cè)不同濃度的H_2O_2作用于MRC-5細(xì)胞的抑制率,選取H_2O_2最佳造模濃度和造模時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。然后分別選取濃度為5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、0.1562mg/ml的丹酚酸A,運(yùn)用CCK-8法測(cè)定不同濃度丹酚酸A對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制情況,選取實(shí)驗(yàn)的最大無毒濃度,以此稀釋三個(gè)濃度,處理MRC-5細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組(A組)、H_2O_2組(B組)、丹酚酸A高濃度組(C組)、H_2O_2+丹酚酸A高濃度組(D組)、H_2O_2+丹酚酸A中濃度組(E組)、H_2O_2+丹酚酸A低濃度組(F組)。以6h、12h、24h為時(shí)間監(jiān)測(cè)點(diǎn),檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)SOD、CAT、MDA、GSH的表達(dá)并比較�；贜otch1信號(hào)通路探討丹酚酸A對(duì)H_2O_2致MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)機(jī)制。Western blotting檢測(cè)各組24h Notch1、JAG1、Hes1的蛋白表達(dá);RT-PCR檢測(cè)各組24h Notch1mRNA、JAG1mRNA、Hes1mRNA的表達(dá);用免疫熒光化學(xué)法觀察24h膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)。結(jié)果:1.H_2O_2最佳造模濃度以及丹酚酸A最佳作用濃度的選擇1.1當(dāng)H_2O_2濃度600μmol/L孵育24h時(shí),使細(xì)胞抑制率達(dá)到33.96%,該刺激濃度、作用時(shí)間以及對(duì)于細(xì)胞的損傷抑制程度符合最佳造模需求,故以600μmol/L H_2O_2預(yù)刺激24小時(shí)誘導(dǎo)的MRC-5氧化損傷模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.當(dāng)?shù)し铀酇的藥物濃度達(dá)2.5mg/ml時(shí),使細(xì)胞抑制率達(dá)到10.94%,該藥物劑量下,細(xì)胞抑制率較低,對(duì)MRC-5細(xì)胞損傷小,藥物濃度相對(duì)安全,可以考慮將2.5mg/ml定為該實(shí)驗(yàn)的藥物最大無毒濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.觀察丹酚酸A對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用丹酚酸A能明顯提高M(jìn)RC-5細(xì)胞內(nèi)各抗氧化指標(biāo)SOD、CAT、GSH活力,同時(shí)能顯著降低提示機(jī)體氧化損傷的指標(biāo)MDA表達(dá)水平,顯示有濃度依賴性,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P0.05)。3.基于Notch1信號(hào)通路探討丹酚酸A對(duì)H_2O_2致MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)機(jī)制丹酚酸A能明顯降低H_2O_2誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞Notch1,JAG1,Hes1的表達(dá)水平,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.觀察丹酚酸A對(duì)MRC-5細(xì)胞24h膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)丹酚酸A能夠明顯抑制MRC-5細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá),提高機(jī)體的抗氧化能力。結(jié)論:1.一定濃度的丹酚酸A可上調(diào)MRC-5細(xì)胞應(yīng)激水平發(fā)揮對(duì)氧化損傷的治療作用。2.H_2O_2干預(yù)可以上調(diào)Notch1、JAG1、Hes1的表達(dá),一定濃度的丹酚酸A可以顯著下調(diào)Notch1、JAG1、Hes1的表達(dá),提示Notch1信號(hào)通路在氧化應(yīng)激損傷過程中扮演重要角色,丹酚酸A可以有效拮抗MRC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,且通過調(diào)控Notch1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn),發(fā)揮抗氧化的作用。3.丹酚酸A能夠抑制膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的表達(dá),提示一定濃度的丹酚酸A具有上調(diào)機(jī)體抗氧化損傷的作用。
【圖文】：

圖 1 不同濃度差異的 H2O2不同作用時(shí)間對(duì) MRC-5 細(xì)胞損傷的影響8 法測(cè)定不同濃度丹酚酸 A 對(duì) MRC-5 細(xì)胞增殖的抑制情況 2 可以看出，，與對(duì)照組相比，隨著丹酚酸 A 藥物作用濃度的不斷抑制程度逐漸增強(qiáng)，此過程呈現(xiàn)出濃度依賴性，當(dāng)?shù)し铀?A 的藥 時(shí)，使細(xì)胞抑制率達(dá)到 10.94%，該藥物劑量下，細(xì)胞抑制率較低小，藥物濃度相對(duì)安全，可以考慮將 2.5mg/ml 丹酚酸 A 藥物濃度無毒濃度，以此稀釋三個(gè)濃度，分別以 2.5mg/ml、1.25mg/ml、0低濃度處理 MRC-5 細(xì)胞。

1 不同濃度差異的 H2O2不同作用時(shí)間對(duì) MRC-5 細(xì)胞損傷的測(cè)定不同濃度丹酚酸 A 對(duì) MRC-5 細(xì)胞增殖的抑制情況以看出，與對(duì)照組相比，隨著丹酚酸 A 藥物作用濃度的不制程度逐漸增強(qiáng)，此過程呈現(xiàn)出濃度依賴性，當(dāng)?shù)し铀?A ，使細(xì)胞抑制率達(dá)到 10.94%，該藥物劑量下，細(xì)胞抑制率較藥物濃度相對(duì)安全，可以考慮將 2.5mg/ml 丹酚酸 A 藥物濃度，以此稀釋三個(gè)濃度，分別以 2.5mg/ml、1.25mg/ml度處理 MRC-5 細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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