發(fā)布時間：2020-04-11 17:29

【摘要】：卵巢功能下降是婦科內分泌領域及生殖領域的常見問題,進一步發(fā)展可導致卵巢功能的衰竭。由于導致卵巢功能下降的病因復雜,現(xiàn)代研究尚未明確其發(fā)病機制,西醫(yī)對改善卵巢功能尚缺乏明確有效的治療措施。近年來,中醫(yī)藥被廣泛應用于提高卵巢功能的臨床治療和實驗研究,并取得了一定的研究進展,但同時也面臨著許多問題,如缺乏中藥復方制劑,未明確中藥對該病的作用機理等。本項目研究中的“養(yǎng)陰舒肝顆�！笔怯赏跣≡平淌诮�(jīng)過30多年的臨床實踐總結而來,臨床用于提高卵巢功能的治療,在長期的臨床使用中療效明確,且未有不良反應、毒副作用的報道�；陴B(yǎng)陰舒肝顆粒良好的臨床療效,本研究將進一步從藥理學角度探討該藥的療效、作用機制及安全性評價,為養(yǎng)陰舒肝顆粒改善卵巢功能提供實驗依據(jù),同時為新藥的研發(fā)提供科學基礎。目的:1.研究養(yǎng)陰舒肝顆粒對去氧乙烯基環(huán)己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)誘導卵巢功能下降大鼠卵巢功能的影響及可能的作用機制。2.研究不同劑量的養(yǎng)陰舒肝顆粒對SD大鼠的影響,初步評價其安全性。方法:1.養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠的藥效及機制研究選取動情周期規(guī)則的70只8周齡雌性SD大鼠,取10只大鼠作為空白組,除空白組外,其余SD雌性大鼠每天1次腹腔注射160mg/kg VCD,連續(xù)注射15d,建立卵巢功能下降大鼠模型�？瞻捉M腹腔注射生理鹽水,連續(xù)注射15 d。取造模成功大鼠56只按體重隨機分為5組,模型組、養(yǎng)陰舒肝低、中、高劑量組、坤泰膠囊組,每組11只(模型組12只)。各給藥組大鼠均按劑量每天1次灌胃10 ml/kg,空白組、模型組大鼠給予等體積蒸餾水,連續(xù)4周。觀察大鼠的一般情況、體重變化,記錄大鼠的動情周期,將大鼠麻醉取材后,進行卵巢稱重和計算卵巢指數(shù),觀察卵巢組織形態(tài)學的變化,對各級卵泡數(shù)目進行計數(shù),采用酶聯(lián)免疫法檢測血清性激素(FSH、E_2、AMH)水平和氧化相關物質(SOD、GSH-PX、MDA)的含量,采用免疫組化法檢測卵巢組織PI3K、Akt、FoxO3a蛋白的表達水平,采用蛋白免疫印跡法檢測卵巢組織FoxO3a蛋白及凋亡因子(Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白)的表達水平。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析。2.養(yǎng)陰舒肝顆粒的安全性評價實驗選取5~6周齡的160只雌性SD大鼠,適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為:空白組、養(yǎng)陰舒肝低劑量組、養(yǎng)陰舒肝中劑量組和養(yǎng)陰舒肝高劑量組,按15 mL/kg分別經(jīng)口灌胃蒸餾水、0.26g浸膏/mL、0.51g浸膏/mL及1.02g浸膏/mL,每天1次,連續(xù)灌胃13周。觀察養(yǎng)陰舒肝顆粒對大鼠一般情況、血液學、肝腎功能的影響。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析。結果:1.養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠的藥效及機制研究(1)養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠一般情況及動情周期的影響(1)大鼠的一般情況:與空白組比較,模型組皮毛疏散,活動減弱,飲食減少,腹脹明顯,出現(xiàn)腹瀉。與模型組比較,養(yǎng)陰舒肝顆粒各劑量組大鼠的一般情況均逐漸好轉,腹脹、腹瀉也可見明顯好轉;坤泰膠囊組大鼠的活動、飲食等一般情況逐漸好轉,但腹脹、腹瀉未見明顯好轉。(2)大鼠的體重:給藥4周后與給藥2周比較,各藥物組大鼠的體重均呈增長趨勢。給藥4周后,與空白組比較,模型組大鼠的體重下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,養(yǎng)陰舒肝低、中劑量組大鼠的體重均呈增長趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。養(yǎng)陰舒肝各劑量組與坤泰膠囊組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。養(yǎng)陰舒肝中劑量組與低劑量組、高劑量組療效相當,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。(3)大鼠的動情周期:與空白組比較,模型組大鼠的動情周期出現(xiàn)延長,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,養(yǎng)陰舒肝中、高劑量組和坤泰膠囊組大鼠動情周期出現(xiàn)延長的數(shù)目明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝中、高劑量組與坤泰膠囊組療效相當,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。養(yǎng)陰舒肝中劑量組優(yōu)于低劑量組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠卵巢重量和卵巢指數(shù)的影響(1)卵巢重量:與空白組比較,模型組大鼠的雙側卵巢重量均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,養(yǎng)陰舒肝低、高劑量組大鼠的雙側卵巢重量和中劑量組的左側卵巢重量均明顯增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝高劑量組優(yōu)于坤泰膠囊組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。養(yǎng)陰舒肝中劑量組與養(yǎng)陰舒肝低、高劑量組療效相當,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。(2)卵巢指數(shù):與空白組比較,模型組大鼠的卵巢指數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,養(yǎng)陰舒肝各劑量組和坤泰膠囊組的卵巢指數(shù)均增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝高劑量組優(yōu)于坤泰膠囊組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。養(yǎng)陰舒肝中劑量組與養(yǎng)陰舒肝低、高劑量組療效相當,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。(3)養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠的卵巢組織形態(tài)學觀察、卵泡計數(shù)的影響(1)卵巢組織形態(tài)學觀察:與空白組比較,模型組卵巢結構紊亂,皮質出現(xiàn)增生伴纖維化,顆粒細胞排列疏松,各級發(fā)育及成熟卵泡數(shù)目減少,其中以始基卵泡、初級卵泡的數(shù)目明顯減少,結構破壞,閉鎖卵泡數(shù)目明顯增多,伴有炎性浸潤,髓質部分發(fā)生萎縮。與模型組比較,各給藥組大鼠的卵巢皮質增生較少,可見正常形態(tài)的卵泡,始基卵泡、初級卵泡數(shù)目增多,閉鎖卵泡數(shù)目減少,髓質無明顯萎縮。(2)各級卵泡計數(shù):與空白組比較,模型組大鼠的始基卵泡、初級卵泡數(shù)目明顯下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01);次級卵泡、成熟卵泡數(shù)目增加,但差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05);閉鎖卵泡數(shù)目明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,各給藥組有提高各級發(fā)育和成熟卵泡數(shù)目的趨勢,但差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。在降低閉鎖卵泡的數(shù)目方面,與模型組比較,養(yǎng)陰舒肝低、中劑量組的閉鎖卵泡數(shù)目均減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝低劑量組的療效優(yōu)于坤泰膠囊組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠血清性激素水平的影響與空白組比較,模型組血清FSH水平升高、E_2和AMH水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與模型組比較,各給藥組血清FSH水平均呈下降趨勢,血清E_2和AMH水平均呈升高趨勢,其中養(yǎng)陰舒肝高劑量組和坤泰膠囊組的差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),養(yǎng)陰舒肝高劑量組與坤泰膠囊組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。(5)養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠氧化相關物質的影響與空白組比較,模型組血清GSH-PX和SOD活力均降低、MDA水平升高,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與模型組比較,各給藥組血清GSH-PX和SOD活力均呈升高趨勢、MDA水平呈下降趨勢,其中養(yǎng)陰舒肝高劑量組和坤泰膠囊組的差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。養(yǎng)陰舒肝高劑量組與坤泰膠囊組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。(6)養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠卵巢組織PI3K/AKT/FoxO3a通路相關蛋白的影響(1)卵巢組織PI3K蛋白的表達水平:與空白組比較,模型組PI3K蛋白表達水平顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型組比較,養(yǎng)陰舒肝中、高劑量組及坤泰膠囊組PI3K蛋白表達水平明顯上調,差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝中、高劑量組與坤泰膠囊組療效相當,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。養(yǎng)陰舒肝中劑量組與養(yǎng)陰舒肝其他(低、高)劑量組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)(2)卵巢組織Akt蛋白的表達水平:與空白組比較,模型組Akt蛋白表達水平顯著下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型組比較,各給藥組Akt蛋白表達水平均明顯上調,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照藥物組比較,坤泰膠囊組優(yōu)于養(yǎng)陰舒肝低劑量組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。養(yǎng)陰舒肝各劑量組呈量效遞增關系,養(yǎng)陰舒肝高劑量組優(yōu)于中劑量組,養(yǎng)陰舒肝中劑量組優(yōu)于低劑量組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01)。(3)卵巢組織FoxO3a蛋白的表達水平:采用免疫組化法檢測,與空白組比較,模型組FoxO3a蛋白表達水平顯著上調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);各給藥組大鼠的FoxO3a蛋白水平均顯著下調,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝中、高劑量組均優(yōu)于坤泰膠囊組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01)。養(yǎng)陰舒肝中劑量組與養(yǎng)陰舒肝其他(低、高)劑量組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。采用蛋白免疫印跡法檢測,與空白組比較,模型組FoxO3a蛋白表達量明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);各給藥組大鼠的FoxO3a蛋白表達量均明顯減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝中、高劑量組優(yōu)于坤泰膠囊組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。養(yǎng)陰舒肝顆粒呈量效遞增關系,養(yǎng)陰舒肝高劑量組優(yōu)于中劑量組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01)。(7)養(yǎng)陰舒肝顆粒對卵巢功能下降大鼠卵巢組織凋亡相關蛋白表達水平的影響(1)卵巢組織Bcl-2蛋白的表達水平:與空白組比較,模型組大鼠的Bcl-2蛋白表達量顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,各藥物干預組大鼠的Bcl-2蛋白表達量均明顯增多,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝中劑量組優(yōu)于坤泰膠囊組,差異均統(tǒng)計學意義(P0.01)。養(yǎng)陰舒肝中劑量組優(yōu)于低、高劑量組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(2)卵巢組織Bax蛋白的表達水平:與空白組比較,模型組大鼠Bax蛋白的表達量顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,各給藥組大鼠的Bax蛋白表達量均明顯減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝高劑量組優(yōu)于坤泰膠囊組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。養(yǎng)陰舒肝各劑量組之間呈量效遞增關系,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(3)卵巢組織Caspase-3蛋白的表達水平:與空白組比較,模型組大鼠的Caspase-3蛋白表達量顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與模型組比較,各給藥組大鼠的Caspase-3蛋白表達量均明顯減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與對照藥物組比較,養(yǎng)陰舒肝中、高劑量組療效優(yōu)于坤泰膠囊組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05,P0.01)。養(yǎng)陰舒肝各劑量組之間呈量效遞增關系,高劑量組療效優(yōu)于中劑量組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.養(yǎng)陰舒肝顆粒的安全性評價實驗(1)養(yǎng)陰舒肝顆粒對大鼠一般情況的影響實驗期間,各組大鼠均無死亡,也未出現(xiàn)明顯的毒性反應。與空白組比較,養(yǎng)陰舒肝各劑量組大鼠的外觀體征、行為活動,飲食及排泄物均正常。(2)養(yǎng)陰舒肝顆粒對大鼠血液各項指標的影響與空白組比較,養(yǎng)陰舒肝各劑量組WBC數(shù)目、Neu數(shù)目及PLT數(shù)目的差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05);養(yǎng)陰舒肝各劑量組的RBC數(shù)目和HGB含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(3)養(yǎng)陰舒肝顆粒對大鼠肝腎功能的影響與空白組比較,養(yǎng)陰舒肝各劑量組血清ALT、AST水平的差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05);養(yǎng)陰舒肝各劑量組血清BUN、CRE的差異均無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。結論:1.采用連續(xù)15天腹腔注射160 mg/kg VCD進行造模,大鼠的動情周期出現(xiàn)延長,造模成功。2.養(yǎng)陰舒肝顆�？梢愿纳坡殉补δ芟陆荡笫蟮囊话銧顩r,尤以對腹脹改善明顯。3.養(yǎng)陰舒肝顆�？纱龠M卵巢功能下降大鼠動情周期的恢復。4.養(yǎng)陰舒肝顆�？稍黾勇殉补δ芟陆荡笫蟮碾p側卵巢重量和卵巢指數(shù)。5.養(yǎng)陰舒肝顆粒可改善卵巢功能下降大鼠的卵巢組織結構,使得各級發(fā)育卵泡和成熟卵泡的數(shù)目呈上升趨勢;養(yǎng)陰舒肝顆�？擅黠@減少閉鎖卵泡數(shù)目。6.養(yǎng)陰舒肝顆�？烧{節(jié)卵巢功能下降大鼠的性激素(AMH、FSH及E_2)水平,降低血清FSH水平,升高血清AMH、E_2水平,其中以高劑量療效明顯。7.養(yǎng)陰舒肝顆�？商岣哐錑SH-PX、SOD的活力,降低MDA水平,發(fā)揮抗氧化效應,其中以高劑量療效明顯。8.養(yǎng)陰舒肝顆�？烧{節(jié)卵巢組織PI3K/Akt/FoxO3a通路相關蛋白的表達水平,增加PI3K、Akt蛋白的表達量,降低FoxO3a蛋白的表達量。9.養(yǎng)陰舒肝顆�？烧{節(jié)卵巢組織凋亡相關蛋白的表達水平,增加Bcl-2蛋白的表達量,減少Bax、Caspase-3蛋白的表達量,從而抑制凋亡。10.安全性評價實驗中大鼠的一般狀況良好,未出現(xiàn)死亡、毒性反應,無明顯的肝腎功能的損害,初步表明養(yǎng)陰舒肝顆粒應用的安全性。11.養(yǎng)陰舒肝顆�？筛纳坡殉补δ芟陆荡笫蟮穆殉补δ�,其機制可能是通過調節(jié)了卵巢組織PI3K/Akt/FoxO3a的信號通路及抑制凋亡實現(xiàn)的,且該藥具有安全性。本研究為養(yǎng)陰舒肝顆粒的研發(fā)與推廣應用提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

正常大鼠不同時期動情周期的變化（×40）

養(yǎng)陰舒肝顆粒改善卵巢功能下降大鼠卵巢功能的相關信號通路示意圖
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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3 藺會蘭;孫曉慧;金立娟;劉俊霞;田碩;張藝瑋;鐔麗霞;;血漿Mir-21與卵巢功能減退相關性研究[J];河北醫(yī)藥;2015年10期

4 溫丹婷;李秀銘;張茜;劉志清;周慧萍;王小云;曹立幸;徐珉;;李麗蕓教授治療卵巢儲備功能降低不孕中醫(yī)臨證思考[J];時珍國醫(yī)國藥;2015年01期

5 陸櫻瑜;沈明潔;李佳慧;齊聰;;卵巢儲備功能下降動物模型研究進展[J];生殖醫(yī)學雜志;2014年12期

6 嚴航;;何嘉琳治療卵巢儲備功能下降的經(jīng)驗[J];浙江中醫(yī)藥大學學報;2014年09期

7 米東;張云山;;抗苗勒氏管激素在婦產(chǎn)科領域的研究進展[J];生殖與避孕;2014年08期

8 馮敬華;孔麗蔚;李柳麗;;卵巢儲備功能下降病因與治療的中西醫(yī)研究進展[J];中國醫(yī)藥導報;2014年14期

9 周全;臘曉琳;;卵巢儲備功能下降的治療進展[J];新疆醫(yī)科大學學報;2014年04期

10 馮璇;王小云;;王小云教授“以情勝情”法治療更年期女性情志障礙經(jīng)驗[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年03期

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3 王偉明;電針對原發(fā)性卵巢功能不全模型大鼠卵巢保護和改善的效應與機制[D];北京中醫(yī)藥大學;2015年

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3 蔡玉梅;滋腎疏肝法治療卵巢儲備功能下降的臨床觀察[D];云南中醫(yī)學院;2017年

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8 楊夢佳;1201例子宮動脈栓塞術并發(fā)癥分析[D];浙江大學;2016年

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本文編號：2623849