發(fā)布時(shí)間：2020-04-11 02:14

【摘要】：目的:探究苦參素(matrine,MAT)對多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)的經(jīng)典動物模型—實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠的神經(jīng)功能學(xué)指征和腦組織病理學(xué)特征的影響,通過觀察其中星形膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物—膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPG)的含量變化探究MAT對EAE大鼠腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況的影響。同時(shí),檢測分析其中鞘氨醇(sphingosin,SPH),磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)和血漿凝溶膠蛋白(plasma gelsolin,pGSN)的含量變化,鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SPHK)的表達(dá)變化以及星形膠質(zhì)細(xì)胞表面磷酸鞘氨醇1型受體(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1P1)表達(dá)的變化情況,探究MAT抑制EAE大鼠腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生現(xiàn)象的作用機(jī)制,為臨床探索治療MS的方法提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。方法:1.建立EAE大鼠模型:在冰浴和無菌條件下制備豚鼠全脊髓勻漿(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH),與等體積含卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)6mg/ml的完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)均勻混合,制成穩(wěn)定的油包水(W/O)型抗原乳劑,四肢足墊皮下注射6~8周齡的雌性Wistar大鼠(0.5ml/只),建立GPSCH誘導(dǎo)的EAE大鼠模型。自免疫當(dāng)天起,由兩名實(shí)驗(yàn)人員每日獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物神經(jīng)功能學(xué)評分。2.動物分組及給藥:采用隨機(jī)數(shù)字表法,將30只免疫后大鼠分為三組:EAE模型組(EAE+Saline)-自免疫后第1天起每日腹腔注射生理鹽水(6.7ml/kg);苦參素治療組(EAE+MAT)-自免疫后第11天起每日注射用生理鹽水稀釋后的苦參素注射液6.7 ml/kg(250mg/kg)和苦參素預(yù)防組EAE+MAT-P(MATPretreatment)-自免疫后第1天起實(shí)施與苦參素治療組等量的治療措施。三組實(shí)驗(yàn)動物均干預(yù)至免疫后第17天。3.動物標(biāo)本采集:免疫后第18天,將動物麻醉后,用生理鹽水心臟灌注后留取大鼠腦組織并用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)沖洗。之后將右腦立即投入液氮中保存,左腦用4%多聚甲醛固定保存。4.相關(guān)指標(biāo)檢測:蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)和勞克堅(jiān)牢藍(lán)((Luxol fast blue,LFB)染色分別觀察動物腦組織中炎性浸潤和脫髓鞘的情況,免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence,IF)檢測GFAP、CSPG的表達(dá)以及GFAP與S1P1的共表達(dá),蛋白質(zhì)印記法(western blot,WB)檢測GFAP、pGSN的表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)測定SPH和S1P濃度,定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測SPHK1和SPHK2的mRNA表達(dá)。使用GraphPad Prism6.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1.神經(jīng)功能學(xué)評分:統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,在EAE大鼠的發(fā)病高峰期(免疫后第18日),苦參素治療組大鼠的神經(jīng)功能學(xué)評分低于EAE模型組(P0.001),且預(yù)防組與治療組大鼠的神經(jīng)功能學(xué)評分也存在顯著差異(P0.05)。2.腦組織病理學(xué)變化:與EAE模型組相較,苦參素對照組大鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘的情況明顯緩解(P0.001,P0.01),苦參素預(yù)防組的情況又較于對照組發(fā)生明顯緩解(P0.05,P0.01)。3.腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生情況的變化:western blot與免疫熒光染色結(jié)果顯示,與苦參素治療組相較,EAE模型組大鼠腦內(nèi)的GFAP蛋白的表達(dá)量和熒光強(qiáng)度都明顯更高(P0.001,P0.01),而苦參素預(yù)防組則較治療組表達(dá)更低(P0.001,P0.01);與EAE模型組相較,苦參素治療組大鼠腦內(nèi)的CSPG的熒光強(qiáng)度亦表達(dá)顯著降低(P0.01),而苦參素預(yù)防組則表現(xiàn)出更低的趨勢(P0.05)。4.腦組織中S1P,SPH,pGSN的蛋白表達(dá)及SPHK1和SPHK2 mRNA的表達(dá)變化:ELISA結(jié)果顯示,與EAE模型組相比,苦參素治療組大鼠腦內(nèi)S1P和SPH的含量均顯著降低(P0.001,P0.001),苦參素預(yù)防組亦較治療組顯著降低(P0.001,P0.001);qRT-PCR結(jié)果表明,經(jīng)苦參素治療后,EAE模型組大鼠腦內(nèi)SPHK1和SPHK2 mRNA的表達(dá)均明顯減少(P0.05,P0.001);與苦參素治療組相比,苦參素預(yù)防組大鼠腦內(nèi)SPHK1 mRNA的表達(dá)量發(fā)生顯著降低(P0.001),而兩組的SPHK2 mRNA表達(dá)量則無顯著差異。此外,用western blot檢測腦組織內(nèi)pGSN表達(dá),結(jié)果顯示與EAE模型組相比,苦參素治療明顯提升了大鼠腦內(nèi)pGSN蛋白的表達(dá)量(P0.001),而苦參素預(yù)防組的pGSN蛋白量亦明顯低于苦參素治療組(P0.001)。5.腦內(nèi)及星形膠質(zhì)細(xì)胞上的S1P1的表達(dá)量:qRT-PCR結(jié)果顯示,與EAE模型組比較,苦參素治療組大鼠腦內(nèi)S1P1 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P0.001),而苦參素預(yù)防組與之未表現(xiàn)出顯著差異;與此對應(yīng),免疫熒光雙染結(jié)果表明,與苦參素治療組比較,EAE模型組大鼠腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更多的S1P1受體(P0.001),而苦參素預(yù)防組未表現(xiàn)出與模型組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:MAT對EAE大鼠有良好的治療及預(yù)防效果,可以顯著抑制EAE大鼠腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。MAT可以顯著降低EAE大鼠腦內(nèi)的S1P含量,是通過抑制SPH的產(chǎn)生和SPHK12的表達(dá),上調(diào)pGSN,并且抑制S1P1在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá),從而起到對EAE大鼠病情的治療及預(yù)防作用。
【圖文】：

13圖 1 MAT 改善 EAE 大鼠臨床癥狀以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和髓鞘脫失情況采用豚鼠脊髓勻漿法誘導(dǎo) Wistar 大鼠發(fā)生 EAE。大鼠于免疫后第 11 天和第 1 天分 治療和預(yù)處理(250 mg/kg/日，腹腔注射)。EAE 模型組大鼠每日腹腔注射等量的生理照“材料和方法”一節(jié)所述評測神經(jīng)功能評分的評分-時(shí)間曲線。(B) HE 染色和 LFB NS 炎癥和髓鞘脫失(比例尺= 100μm)。(C) 炎癥和脫髓鞘的平均評分。數(shù)據(jù)均用均數(shù)示，每組 n = 10。* P < 0.05，** P < 0.01，***P < 0.001。

14圖 2 MAT 抑制 EAE 星形膠質(zhì)細(xì)胞增生(A) (B) Western blot 檢測大鼠腦組織中 GFAP 表達(dá)。(C) (D)免疫熒光染色檢測腦組織中 GFAP表達(dá)。用 GFAP 單次免疫熒光染色(×200)檢測三組星形膠質(zhì)細(xì)胞(紅色)特征以及 GFAP 表達(dá)的定量分析。 (E) (F)免疫熒光雙染檢測腦組織中 CSPG+(紅色)與 GFAP+(綠色)共表達(dá)(×200)以及CSPG 表達(dá)的定量分析。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，，每組 n = 10。* P < 0.05， ** P < 0.01，*** P < 0.001。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2623015