【摘要】：研究背景:基于中醫(yī)藥的臨床用方經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代漲落效應(yīng)理論,本學(xué)科曾提出中醫(yī)復(fù)方進(jìn)入體內(nèi)后的多種微量成分共同作用于生物體而產(chǎn)生整體效應(yīng)的觀念,并提出復(fù)方作用可能存在“效閾濃度或極低濃度下多成分的生物效應(yīng)模式”的假說(shuō)。如果這些推測(cè)得到驗(yàn)證,將對(duì)包括中醫(yī)方藥效應(yīng)在內(nèi)的復(fù)雜生命現(xiàn)象的理解提供一個(gè)全新的視角,發(fā)現(xiàn)極低濃度下的中藥多種成分共存下的生物效應(yīng)的普遍現(xiàn)象也會(huì)對(duì)包括中、西藥在內(nèi)的新藥研制產(chǎn)生革命性的影響。目的:基于學(xué)科前期的工作基礎(chǔ),擬以葛根芩連湯方中4味中藥所涉及的四種化學(xué)成分(葛根素、黃芩素、小檗堿、甘草酸)及其配伍作為該方成分配伍的表征,以2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的胰島素抵抗(IR)機(jī)制的研究為背景,選擇IR的重要靶器官/靶細(xì)胞—肝細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)作為探查工具,運(yùn)用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),在觀察各單體成分不同濃度對(duì)該細(xì)胞IR模型的糖代謝作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察其效閾下的極低濃度配伍的抗IR效應(yīng)及機(jī)理,以探討中藥復(fù)方多成分低濃度下配伍的生物效應(yīng)模式,為論證中醫(yī)方劑效用原理中“極低濃度下的多成分配伍效應(yīng)”的推測(cè)提供新的依據(jù),同時(shí)為多成分配方極低濃度條件下的作用機(jī)制提供分子水平上的理解。方法:(1)4種單體成分的體外安全濃度范圍:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后,棄掉原培養(yǎng)液,加入終濃度分別為10-9、10-8 10-7、10-6、10-5、10-4mol/L葛根素、黃芩素、小檗堿、甘草酸,正常組加入相同體積的培養(yǎng)液;放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。采用CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖活力,得到各單體成分體外安全濃度范圍。(2)HepG2 IR細(xì)胞模型復(fù)制的方法學(xué)考察:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,接種于96孔板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,吸棄培養(yǎng)液,換成無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓處理12h,吸棄培養(yǎng)液。正常組加入正常培養(yǎng)基,模型組加入新配制的含25mmol/L葡萄糖和胰島素濃度分別為1×10-9～1×10-5mol/L的培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h和72h。采用CCK-8法和葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法,檢測(cè)各濃度胰島素對(duì)細(xì)胞增殖活力和葡萄糖消耗量的影響,篩選最佳胰島素作用濃度和作用時(shí)間。根據(jù)篩選的條件,將細(xì)胞置于不含胰島素的正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24h、48h和72h,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞葡萄糖消耗量,考察細(xì)胞IR模型的穩(wěn)定性。(3)4種單體成分體外抗IR的濃度-效應(yīng)范圍:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,接種于96孔板,分為正常組、模型組和給藥組。給藥組加入終濃度分別為10-11～10-5mol/L葛根素、黃芩素、小檗堿、甘草酸,正常組和模型組加入相同體積的含有25mmol/L葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)基;置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在藥物處理24h后,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞增殖活力和葡萄糖消耗量,考察4種單體成分體外抗IR的濃度-效應(yīng)范圍。(4)4種單體成分體外抗IR活性及效應(yīng)機(jī)制:將HepG2細(xì)胞分為正常組、模型組和給藥組。給藥組加入不同濃度(10-6和10-5mol/L)的葛根素、黃芩素、小檗堿、甘草酸和二甲雙胍(10-3mol/L)溶液,正常組和模型組加入相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)基;放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中處理24h。檢測(cè)指標(biāo):1)細(xì)胞增殖活性和葡萄糖消耗量;2)糖利用:細(xì)胞丙酮酸激酶(PK)和葡萄糖激酶(GCK)活性;3)糖異生:葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA表達(dá)水平;4)糖攝取:細(xì)胞胰島素受體(InsR)mRNA表達(dá)水平;5)相關(guān)信號(hào)通路:磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(GLUT2)mmRNA表達(dá)和細(xì)胞胰島素受體底物1(IRS1)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、GLUT2蛋白表達(dá)水平;6)能量代謝:細(xì)胞沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)、沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)mRNA表達(dá)和腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(PGC-1a)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)、核因子相關(guān)因子2(NRF-2)、肉毒堿棕櫚�；D(zhuǎn)移酶1(CPT-1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FOX01)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)蛋白表達(dá)水平。(5)4種單體成分效閾濃度下不同配伍的抗IR效應(yīng)及作用機(jī)制:(1)不同效閾濃度下的4種單體成分組合的抗IR效應(yīng):將HepG2細(xì)胞分為正常組、模型組、各單體各自效閾濃度下(1/4、1/10、1/100、1/1000)的配伍4組以及二甲雙胍(10-3mol/L)組。分別加入含相當(dāng)濃度的各組藥物于細(xì)胞培養(yǎng)基中;置細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中干預(yù)24h。檢測(cè)指標(biāo):細(xì)胞增殖活力和葡萄糖消耗量。(2)4種單體成分1/100效閾濃度不同配伍的抗IR效應(yīng):將HepG2細(xì)胞分為正常組、模型組、葛根素(A,10-11mol/L)組、葛根素+黃芩素(A+B,10-11+10-10mol/L)組、葛根素+黃芩素+小檗堿(A+B+C,10 11+10-10+10-11mol/L)組、葛根素+黃芩素+小檗堿+甘草酸(A+B+C+D,10-11+10-10+10-11+10-10mol/L)組、二甲雙胍(10-3mol/L)組共 7 組,分別加入含相當(dāng)濃度的各組藥物于細(xì)胞培養(yǎng)基中;置細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24h。檢測(cè)指標(biāo):細(xì)胞葡萄糖消耗量;細(xì)胞PK、GCK和GLUT2活性。(3)4種單體成分效閾濃度下的低濃度配方(1/100和1/10)的抗IR作用機(jī)制:將HepG2細(xì)胞分為正常組、模型組、1/100 低濃度配方(A+B+C+D,10-11+10-10+10-11+10-10mol/L)組、1/10 低濃度配方(A+B+C+D,10-10+10-9+10-10+10-9mol/L)組、二甲雙胍(10-3mmol/L)組,分別加入含相當(dāng)濃度的各組藥物于培養(yǎng)基中,放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24h。檢測(cè)指標(biāo):1)糖異生:細(xì)胞 G6Pase、PEPCK mRNA 表達(dá)水平;2)糖攝取:細(xì)胞 GLUT2、InsR、PI3K、AKT mRNA表達(dá)和GLUT2、IRS1、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平;3)能量代謝:細(xì)胞SIRT1、SIRT3 mRNA 表達(dá)和 AMPK、PGC-1α、TFAM、NRF-2、CPT-1、FOX01 和 ACC 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:(1)4種單體成分的體外安全濃度范圍:不同濃度的葛根素、黃芩素、小檗堿和甘草酸對(duì)正常HepG2細(xì)胞增殖活力均呈現(xiàn)一定的抑制作用,4種單體成分在10-9～10-5mol/L濃度區(qū)間體外對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖活性無(wú)明顯影響(P0.05)。(2)HepG2 IR細(xì)胞模型誘導(dǎo)的方法學(xué)考察:體外培養(yǎng)條件下,25mmol/L葡萄糖與10-6mol/L胰島素聯(lián)合誘導(dǎo)24h,可以成功復(fù)制出穩(wěn)定可靠的體外HepG2IR模型,該模型可持續(xù)48h。(3)4種單體成分體外抗IR的濃度-效應(yīng)范圍:一定濃度區(qū)間的葛根素、黃芩素、小檗堿和甘草酸對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖活性均無(wú)明顯影響(P0.05),但對(duì)IR模型糖利用均有不同程度的促進(jìn)作用,并呈現(xiàn)出“量-效”關(guān)系。葛根素和小檗堿有效濃度范圍均為10-9～10-5mol/L,黃芩素和甘草酸有效濃度范圍均為10-8～10-5mol/L。(4)4種單體成分體外抗IR活性及效應(yīng)機(jī)制:一定濃度區(qū)間的葛根素、黃芩素、小檗堿和甘草酸以及二甲雙胍狐對(duì)HepG2 IR模型細(xì)胞均顯著提高葡萄糖消耗量(P0.05或P0.01或P0.001),提高 PK 和 GCK 活性(P0.05 或P0.01 或 P0.001),上調(diào)其 InsR、PI3K、AKT、GLUT2 mRNA(P0.05 或P0.01)和 IRS-1、p-PI3K、p-AKT、GLUT2 蛋白表達(dá)水平(P0.05或 P0.01),下調(diào)其 G6Pase、PEPCKmRNA 表達(dá)水平(P0.05 或P0.01)。此外,葛根素、小檗堿以及二甲雙胍還涉及上調(diào)模型細(xì)胞SIRT1、SIRT3 mmRNA表達(dá)(P0.05或P0.01)和 AMPK、PGC-1 α、TFAM、NRF-2、CPT-1 蛋白表達(dá)水平(P0.05 或P0.01),下調(diào)其FOXO1、ACC蛋白表達(dá)水平(P0.05或P0.01)。(5)4種單體成分效閾濃度下不同配伍的抗IR效應(yīng)及作用機(jī)制:1)4種單體成分各自效閾濃度下1/4、1/10和1/100的配伍對(duì)HepG2 IR細(xì)胞模型的葡萄糖消耗量均有不同程度的改善作用(P0.05或P0.01)。2)對(duì)4種單體效閾濃度下1/100的幾種不同組合配方(A、A+B、A+B+C、A+B+C+D)對(duì)HepG2 IR模型細(xì)胞葡萄糖消耗量、PK、GCK和GLUT2活性相關(guān)指標(biāo)均有不同程度的改善作用(P0.05或P0.01或P0.001),其中4種單體復(fù)合組方(A+B+C+D)的效應(yīng)最佳。(3)4種單體成分效閾濃度下的1/100和1/10低濃度配方均能顯著上調(diào)模型細(xì)胞 InsR、PI3K、AKT、GLUT2 mRNA 表達(dá)(P0.05 或 P0.01 或 P0.001)和 IRS-1、p-PI3K、p-AKT、GLUT2 蛋白表達(dá)水平(P0.05 或 PO.01),下調(diào)其 G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)水平(P0.05或P0.01);同時(shí),還上調(diào)模型細(xì)胞SIRT1、SIRT3mRNA表達(dá)(P0.05 或P0.01)和 AMPK、PGC-1α、TFAM、NRF-2、CPT-1 蛋白表達(dá)水平(P0.05或P0.01),下調(diào)其FOXO1、ACC蛋白表達(dá)水平(P0.05或P0.01)。結(jié)論:(1)葛根素、黃岑素、小檗堿和甘草酸4種單體成分抗肝細(xì)胞IR的生物活性具有較寬的濃度區(qū)間,其中葛根素和小檗堿為10-9～10-5mol/L,黃芩素和甘草酸為10-8～10-5mol/L/。(2)葛根素、黃芩素、小檗堿和甘草酸4種單體成分的抗IR作用涉及改善糖攝取、糖利用功能、抑制糖異生等環(huán)節(jié),涉及調(diào)控IRS1/PI3K/AKT/GLUT2信號(hào)通路;葛根素和小檗堿還涉及調(diào)控AMPK/SIRT/PGC-1 α信號(hào)通路,提示單體成分的作用也可能涉及多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)及多個(gè)通路。(3)葛根素、黃芩素、小檗堿和甘草酸4種單體成分效閾下濃度(10-9～10-8mol/L)的10-2(10-10～10-11mol/L)的配伍仍具有一定抗IR活性,其中由4種單體配伍的全方作用最優(yōu),表明極低濃度下的各成分之間具有一定的協(xié)同增效作用。(4)極低濃度(效閾濃度下的1/100和1/10濃度)的4個(gè)單體配方的抗IR作用機(jī)制涉及改善糖攝取、糖代謝、能量代謝等環(huán)節(jié)及對(duì)IRS1/PI3K/AKT/GLUT2或/和AMPK/SIRT/PGC-1 α信號(hào)通路的調(diào)節(jié),表明極低濃度條件下4種單體成分配方的降血糖作用涉及多個(gè)環(huán)節(jié)并有其一定分子基礎(chǔ)。本課題基于復(fù)雜系統(tǒng)理論對(duì)中藥復(fù)方可能存在的多成分低濃度效應(yīng)模式及其作用機(jī)理進(jìn)行研究,在細(xì)胞水平上再次證實(shí)效閾濃度下(微量)的多種單體配方具有顯著的生物效應(yīng)并有其確切的分子作用機(jī)制。該研究結(jié)果論證中醫(yī)方劑效用原理中存在“多成分極低濃度-效應(yīng)”的模式,從新的視角揭示中藥復(fù)方效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)理具有重要的科學(xué)意義。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2615888