【摘要】：天麻(Rhizoma Gastrodiae)和鉤藤(Ramulus Uncariae cum Uncis)是中醫(yī)臨床上常用的藥對,具有平肝潛陽、熄風(fēng)止痙之功效,常配伍用于治療血管性、肝陽上亢型偏頭痛。組分中藥是指從復(fù)方中各層次藥效物質(zhì)配伍研發(fā)的組分中藥新藥,由張伯禮、王永炎兩位院士在2005年率先提出,目前已成為中藥方劑配伍研究的熱點。巴利森苷A和異鉤藤堿(PI)分別是從天麻和鉤藤中提取出來的活性單體成分,課題組前期研究證明,兩者均為天麻鉤藤藥材中的主要入血成分,研究中同時發(fā)現(xiàn),該成分聯(lián)合給藥對偏頭痛模型大鼠具有藥理活性作用。本課題組目前正在探討能否用單體成分PI配伍來代替單味藥天麻及鉤藤的配伍。由于組分中藥的可控性更強,且有可能達到服用劑量更小、藥效更明確、毒性更可控的目的,具備進一步研究開發(fā)新藥的可能性,具有較大的研究價值。然而組分中藥配伍的機理尤其是體內(nèi)過程評價是目前研究中必須要解決的關(guān)鍵問題。PI在體內(nèi)的代謝過程是怎樣的,聯(lián)合給藥較單獨給藥的優(yōu)勢是什么,其在體內(nèi)是如何分布的,影響了體內(nèi)哪些與偏頭痛相關(guān)的內(nèi)源性成分?這些都是PI組分中藥進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用的關(guān)鍵性問題。本文主要從ADME(藥物進入體內(nèi)后的過程)和脂質(zhì)組學(xué)(藥物影響內(nèi)源性成分的變化)兩方面內(nèi)容研究PI組分中藥對偏頭痛模型大鼠的作用,以期為PI的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。1.生物樣品中PI的LC-MS測定方法的建立為快速準確地分析生物樣品中的PI的含量,本研究建立了兩套完整的生物分析方法。采用AB Sciex Triple Quad?4500中的MRM模式對樣品中的化合物進行定量檢測,正離子模式下,以鹽酸吡格列酮(m/z 357.1-134.1)作為內(nèi)標同時檢測異鉤藤堿(m/z 384.8-241.2)及其代謝物鉤藤堿(m/z 384.8-160.2),負離子模式下,以梔子苷(m/z 433.0-225)作為內(nèi)標同時檢測巴利森苷A(m/z 995.1-726.9)及其代謝物天麻素(m/z 331.1-123.0)。采用COSMOSIL C18(2.1 x 100 mm,2.6μm)色譜柱和0.1%甲酸水-乙腈的梯度運行對樣品進行分離。該方法可獲得優(yōu)美對稱的峰形,且儀器響應(yīng)強度較好。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示:該方法具有良好的線性關(guān)系(正離子方法:r0.9978;負離子方法:r0.9992),日間日內(nèi)準確度在和精密度在可接受范圍內(nèi)(正離子方法:0.09RE6.50,1.50RSD8.39;負離子方法:0.08RE7.08,2.24RSD6.87),基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果證明該方法不受生物樣品中的基質(zhì)的影響(正離子方法:3.74RSD11.52;負離子方法:1.71RSD8.59)且具有良好的提取回收率(正離子方法:2.93RSD6.98;負離子方法:2.30RSD7.17),滿足長期、短期、及反復(fù)凍融的穩(wěn)定性要求(正離子方法:1.91RSD11.36;負離子方法:1.04RSD7.70)。2.PI不同劑量給藥的藥代動力學(xué)對比研究為闡明PI在大鼠體內(nèi)的代謝過程,以及不同給藥劑量下在大鼠體內(nèi)的代謝特征,采用高(異鉤藤堿:巴利森苷A=60:558.6 mg/kg)、中(異鉤藤堿:巴利森苷A=40:372.4 mg/kg)、低(異鉤藤堿:巴利森苷A=20:186.2 mg/kg)三種不同的給藥量對大鼠進行灌胃給藥。采用DAS 3.2.8軟件對不同時間點的化合物的血藥濃度數(shù)據(jù)進行處理,擬合的藥代動力學(xué)參數(shù),另外采用Sigma Plot 10.0進行藥-時曲線圖進行繪制。結(jié)果顯示在不同的給藥劑量下,各化合物藥-時曲線下面積(AUC(0-t))和達峰濃度(C max)呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系。對于異鉤藤堿和鉤藤堿,兩者的半衰期(t1/2z)、達峰時間(Tmax)相近且藥-時曲線的趨勢相似。對于巴利森苷A和天麻素,巴利森苷A存在明顯的雙峰現(xiàn)象,提示該化合物在體內(nèi)存在肝腸循環(huán)過程,從天麻素的AUC(0-t)值可以看出,巴利森苷A在大鼠體內(nèi)極大程度地代謝成了天麻素,兩者的t1/2z和Tmax值也很接近。3.PI單獨與聯(lián)合給藥在偏頭痛模型大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)對比研究為進一步闡明PI在偏頭痛模型大鼠體內(nèi)的代謝過程,以及聯(lián)合給藥較單獨給藥的優(yōu)勢,本章以偏頭痛模型大鼠為對象,采用單獨給藥和聯(lián)合兩種不同給藥方式對其進行處理。實驗結(jié)果顯示在兩種不同的給藥模式下,各個化合物的代謝顯示出較大的差異,在聯(lián)合給藥方式下,異鉤藤堿及其體內(nèi)的代謝物鉤藤堿的AUC(0-t),t1/2z均顯著大于單獨給藥,提示聯(lián)合給藥能促進異鉤藤堿進入血液,增長其半衰期,延長其藥效時間。此外在對巴利森苷A和天麻素的研究中發(fā)現(xiàn),在單獨給藥方式下,巴利森苷A在血液中幾乎檢測不到,聯(lián)合給藥下檢測到的量也是十分微小的,而其代謝物天麻素在血漿中的含量較高,并且在聯(lián)合給藥的方式下,其AUC(0-t)和t1/2z均大于單獨給藥,提示著巴利森苷A進入血液中可能主要通過轉(zhuǎn)化為天麻素發(fā)揮藥效,并且聯(lián)合給藥的方式能促進其在體內(nèi)發(fā)揮藥效。4.PI在正常和偏頭痛模型大鼠體內(nèi)的組織分布對比研究為研究PI在大鼠體內(nèi)的分布情況,以及在正常大鼠體內(nèi)和偏頭痛模型大鼠體內(nèi)的分布差異,以中劑量給予PI后,對給藥后的0.5h,1h和6h大鼠的心、肝、脾、肺、腎、小腸和腦中的藥物濃度進行檢測。結(jié)果表明:異鉤藤堿和鉤藤堿在各個組織中都有分布,異鉤藤堿主要是在腦組織、腎組織和肺組織中分布較高而鉤藤堿主要是在肝、脾和小腸中分布較多。巴利森苷A和天麻素主要分布在小腸中,其它組織中含量較少甚至幾乎沒有檢測。通過比較正常組和模型組中PI在腦組織中的分布,我們發(fā)現(xiàn)給藥后1h,模型組中的異鉤藤堿和天麻素的含量大于正常組,提示偏頭痛病理狀態(tài)可能促進該成分在靶組織中的分布。5.PI抗偏頭痛的脂質(zhì)組學(xué)研究為尋找偏頭痛相關(guān)的脂生物標志物以及研究PI對偏頭痛相關(guān)的脂內(nèi)源性成分的調(diào)節(jié)作用,采用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)對其進行研究。應(yīng)用Dionex Ultimate 3000(UHPLC)Thermo Orbitrap Elite進行相關(guān)脂質(zhì)成分的檢測,采用Waters UPLC○R BEH C18(1.7μm 100*2.1mm)色譜柱進行分離。經(jīng)Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.08.00軟件和R軟件平臺下的XCMS程序包處理后結(jié)合SIMCA-P13.0和SPSS statistics 21軟件對數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果共鑒定16個重要的脂生物標志物,分別為磷脂酰膽堿(PC)類,溶血磷脂酰膽堿(LPC)和磷脂酰乙醇胺(LPE)類,以及鞘脂類的神經(jīng)酰胺(Cer)和鞘磷脂(SM))。同時證明PI對偏頭痛相關(guān)的內(nèi)源性脂質(zhì)成分具有明顯的調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

圖 1 巴利森苷 A 在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Figure 1 Metabolic pathway of parishinAin rats圖 2 異鉤藤堿在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Figure 2 Metabolic pathway of isorhynchophylline in rats

8圖 2 異鉤藤堿在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Figure 2 Metabolic pathway of isorhynchophylline in rats結(jié)麻和鉤藤在我國有著悠久的藥用歷史，臨床上常將其進行配伍使用伍方劑天麻鉤藤飲常被用于治療偏頭痛等癥。但目前的現(xiàn)狀是中藥作用靶點多，有效物質(zhì)不明確等，這些缺點限制了中藥的應(yīng)用和發(fā)為天麻鉤藤的主要活性成分，資源豐富易得，活性物質(zhì)清晰明確，有價值，若能將其體內(nèi)代謝過程和藥效作用機制闡明，將會為其新藥上的支持。
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2613998