【摘要】：婦科千金膠囊(FKQJ)是婦科常用中成藥,由千斤拔、功勞木、金櫻根、單面針等組成,具有清熱除濕、補益氣血化瘀活血等功效,臨床用于治療多種婦科疾病。FKQJ現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控僅限于測定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量,而對于其他成分則無質(zhì)量控制測定標(biāo)準(zhǔn)。個別化學(xué)成分不能反映整體復(fù)方制劑的專屬性、代表性、價值性,個別指標(biāo)性成分的定性定量分析不能反應(yīng)復(fù)方制劑的整體療效和安全性,也不能很好地關(guān)聯(lián)臨床功效和作用機制,難以客觀、全面和準(zhǔn)確地評價中藥復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。為確保質(zhì)量穩(wěn)定一致,本研究以FKQJ為例,開展以生物評價為核心、整合多種質(zhì)控方法的研究,更好地助力FKQJ的質(zhì)量控制,同時為中藥大復(fù)方制劑質(zhì)量評控提供新的思路和參考,主要研究分為以下幾個部分:1.基于多組學(xué)預(yù)測、篩選抗炎活性靶點,為生物評價研究提供生物學(xué)指標(biāo)選擇依據(jù)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,收集FKQJ的主要化學(xué)成分,針對其抗炎藥效作用,構(gòu)建“藥物-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò),篩選、預(yù)測FKQJ的主要作用靶標(biāo)和通路。通過對網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)的分析,篩選FKQJ抗炎的主要效應(yīng)靶標(biāo)共64個,其中包括37個直接作用靶標(biāo)和27個間接作用靶標(biāo)。FKQJ主要是與酶、蛋白等結(jié)合,通過激活RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄、抑制凋亡等生物過程發(fā)揮抗炎作用,主要影響的信號通路TNF、凋亡、MAPK、T細(xì)胞受體等。針對效應(yīng)細(xì)胞富集結(jié)果表明,FKQJ抗炎靶標(biāo)在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞中顯著富集(p0.01)。其中巨噬細(xì)胞是其抗炎的主要效應(yīng)細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞浸潤是慢性炎癥的主要特點。綜合上述分析,可以初步得出如下結(jié)論:FKQJ用于治療慢性炎癥應(yīng)有較好的療效,其抗炎主要效應(yīng)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞,主要作用靶標(biāo)包括PGH2、NOS2等蛋白酶以及IL-1β、IL-6和TNFα等炎性因子,主要作用通路包括TNF信號通路、NOD樣受體信號通路以及Toll樣受體信號通路等。該結(jié)果為后續(xù)開展FKQJ質(zhì)量生物評價研究提供生物學(xué)指標(biāo)選擇依據(jù)。利用代謝組學(xué)技術(shù),篩選FKQJ藥物作用的生物標(biāo)志物。以RAW264.7細(xì)胞為載體,采用LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激建立細(xì)胞炎癥模型,考察FKQJ對于在炎癥刺激下的單核巨噬細(xì)胞RAW264.7代謝產(chǎn)物的變化,結(jié)果表明:模型組、正常組、模型給藥組代謝輪廓區(qū)分明顯,提示FKQJ對小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞的代謝行為影響較大。FKQJ的抗炎作用機制可以主要通過調(diào)節(jié)與炎癥、氨基酸代謝和能量代謝有關(guān)的途徑來實現(xiàn),其中,炎癥相關(guān)通路主要影響了花生四烯酸的新陳代謝,并影響到前列腺素類標(biāo)志物的產(chǎn)生,它的機制與酶的抑制有關(guān)。代謝組學(xué)研究結(jié)果提示,COX-2可以作為FKQJ質(zhì)量生物評價的重要候選指標(biāo)。2.采用點面結(jié)合的方法,分別單一靶點(酶水平)和基因表達譜(細(xì)胞水平)評價FKQJ的抗炎生物活性首次優(yōu)化了基于抑制COX-2酶活性的抗炎生物效價檢測方法。通過優(yōu)化環(huán)氧化酶-2抑制效價檢測試劑盒,提高檢測效果,并通過應(yīng)用加以驗證。對試劑盒相關(guān)實際試劑用量和使用參數(shù)的優(yōu)化,明確了試劑盒的可使用限和不可使用限。孵育時間為5min時檢測結(jié)果更加理想;反復(fù)凍融次數(shù)不宜過多,最好不要超過6次;長時間貯藏應(yīng)選擇-20°C,未用完的試劑放回-20°C不影響使用效果,提高了試劑盒的使用率;待測抑制及的配制溶劑也會影響試劑盒的使用效果,一般選擇DMSO,檢測效果更好,但是并不是適用所有抑制劑的特點,要根據(jù)抑制劑具體問題具體分析�？疾炝说孜�、酶和輔助因子的用量對抑制COX-2活性影響確定其合適用量。通過方法學(xué)考察,明確了該方法精密度高(日內(nèi)RSD=5.13%,日間RSD=6.56%),重復(fù)性(RSD=7.88%)好,方便重現(xiàn)(RSD=10.15%),可以滿足生物評價方法的要求酶用量對抑制COX-2活性影響。開發(fā)了一種基于基因表達譜來評價FKQJ抗炎生物活性的方法。以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為生物檢測器,在FKQJ處理24h后,使用內(nèi)含有30個抗炎指標(biāo)性基因引物的基因芯片和qRT-PCR篩選能夠代表藥物生物活性的m RNA作為指標(biāo)基因。并利用KEGG對篩選結(jié)果進行了通路富集分析。結(jié)果提示,FKQJ刺激Toll-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、TNF signaling pathway發(fā)生顯著下調(diào),但其對三條通路的作用側(cè)重點有所不同,FKQJ主要是下調(diào)了TLR4-NF-κB-TLR2以使Toll-like receptor signaling pathway下調(diào)。在TNF信號通路中,FKQJ主要集中在下調(diào)TNF-α、IL-6、COX-2、iNOS的表達而發(fā)揮抗炎作用,初步驗證了前面的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、代謝組學(xué)研究的預(yù)測結(jié)果。采用超高效液相色譜法(UPLC),測定了FKQJ中綠原酸、阿魏酸、染料木苷、藥根堿、穿心蓮內(nèi)酯、巴馬汀、小檗堿、脫水穿心蓮內(nèi)酯和藁本內(nèi)酯9種成分含量測定方法,并建立了化學(xué)指紋圖譜。測定結(jié)果表明,20批次的FKQJ化學(xué)指紋圖譜相似度較高,但是9個活性成分的含量存在較大差異,批次間各成分的變異系數(shù)分別為11.34%(綠原酸)、19.14%(阿魏酸)、20.19%(染料木苷)、30.79%(藥根堿)、18.19%(穿心蓮內(nèi)酯)、16.43%(巴馬汀)、36.88%(小檗堿)、29.02%(脫水穿心蓮內(nèi)酯)、16.84%(藁本內(nèi)酯),提示在實際生產(chǎn)過程中,要注意控制小檗堿、藥根堿等含量變化。從COX-2抑制的抗炎生物活性來看,藁本內(nèi)酯、巴馬汀與抗炎活性之間存在著顯著的相關(guān)性,說明藁本內(nèi)酯和巴馬汀含量越高,對COX-2酶活性對的抑制活性也性高。提示藁本內(nèi)酯和巴馬汀可能是FKQJ發(fā)揮抗炎作用的有效成分,在實際生產(chǎn)的質(zhì)量控制中,應(yīng)增加對這類化學(xué)成分的檢測,從而確保質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性,更好的助力FKQJ的質(zhì)量控制。為了彌補單一質(zhì)量指標(biāo)性成分對的整體質(zhì)量控制方面的不足,開展關(guān)聯(lián)臨床療效和作用機制的生物評估方法的研究,擬定了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述,本文以FKQJ的抗炎活性為出發(fā)點,探討建立與臨床療效和作用機制有關(guān)的中藥質(zhì)量生物學(xué)評價方法,找出有效成分和指標(biāo),建立新的標(biāo)準(zhǔn)。該方法為中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制和評價提供了新的思路和技術(shù)參考。由于時間和精力有限,FKQJ質(zhì)量生物學(xué)評價方法和標(biāo)準(zhǔn)仍然不夠,研究團隊將進一步驗證和優(yōu)化。
【圖文】：

產(chǎn)工藝和標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的制劑。它體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念和辨證論治思想，是中國傳思想與現(xiàn)代技術(shù)量標(biāo)準(zhǔn)進工藝的結(jié)合產(chǎn)物。近年來，中藥和中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量發(fā)展已經(jīng)取得不錯的成就，但是，放全國，其質(zhì)控現(xiàn)狀依然令人擔(dān)憂�，F(xiàn)在的質(zhì)量控制方法和模式難以關(guān)聯(lián)其臨床效和作用機制，也難以表達中藥及中藥復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量，這也是制約質(zhì)量控發(fā)展的關(guān)鍵問題(圖 1)�，F(xiàn)行的關(guān)于中藥復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括《中國藥典》、部頒標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)等，，大多是在顯微、薄層鑒別的基礎(chǔ)上，加上個別指標(biāo)性成分的定性定量分析為質(zhì)量控制手段，然而中藥復(fù)方制劑化學(xué)成分更加復(fù)雜，大部分成分藥效與毒作用尚未完全闡明，且經(jīng)過復(fù)方配伍成分之間的協(xié)同和拮抗作用更為多樣，僅測一個或幾個化學(xué)成分并不能完全反應(yīng)復(fù)方制劑的整體療效和安全性，還存在為。因此，建立中藥復(fù)方制劑新的質(zhì)量評控模式及方法已成為中藥復(fù)方制劑質(zhì)控制面臨的重大挑戰(zhàn)之一。

圖 3 中藥與生物藥、化學(xué)藥生產(chǎn)質(zhì)量控制模式的合理性Fig. 3 The rationality of quality control model for chinese medicine, biological medicine andchemical medicine生物檢定是在嚴(yán)格控制的試驗條件下，以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物測定學(xué)為工具，采用特定的實驗設(shè)計，對使用生物體（整個動物、體外組織、器官、細(xì)胞、微生物等）的藥物的生物活性（包括功效和毒性）對藥物進行評估的一種方法[2]，通過比較供試品產(chǎn)生的特定反應(yīng)和等效標(biāo)準(zhǔn)來評估藥物的效力或毒性[3-4]。該方法的應(yīng)用尚不清楚該藥物的有效成分，或該有效成分的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常規(guī)化學(xué)定量方法無法測定該藥物，或其含量不能真實反映其臨床療效的藥物具有重要意義。從生物評價發(fā)展來看（圖 4），中藥的生物評價方法歷史淵源。進入 21 世紀(jì)后，科技不斷進步和發(fā)展，人們的質(zhì)控意識逐步增強，對中藥化學(xué)評價的局限
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R286.0

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