發(fā)布時間：2020-04-03 10:54

【摘要】：婦科千金膠囊(FKQJ)是婦科常用中成藥,由千斤拔、功勞木、金櫻根、單面針等組成,具有清熱除濕、補益氣血化瘀活血等功效,臨床用于治療多種婦科疾病。FKQJ現(xiàn)行藥典標準質(zhì)控僅限于測定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量,而對于其他成分則無質(zhì)量控制測定標準。個別化學成分不能反映整體復方制劑的專屬性、代表性、價值性,個別指標性成分的定性定量分析不能反應復方制劑的整體療效和安全性,也不能很好地關聯(lián)臨床功效和作用機制,難以客觀、全面和準確地評價中藥復方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。為確保質(zhì)量穩(wěn)定一致,本研究以FKQJ為例,開展以生物評價為核心、整合多種質(zhì)控方法的研究,更好地助力FKQJ的質(zhì)量控制,同時為中藥大復方制劑質(zhì)量評控提供新的思路和參考,主要研究分為以下幾個部分:1.基于多組學預測、篩選抗炎活性靶點,為生物評價研究提供生物學指標選擇依據(jù)利用網(wǎng)絡藥理學方法,收集FKQJ的主要化學成分,針對其抗炎藥效作用,構建“藥物-靶標-疾病”網(wǎng)絡,篩選、預測FKQJ的主要作用靶標和通路。通過對網(wǎng)絡拓撲參數(shù)的分析,篩選FKQJ抗炎的主要效應靶標共64個,其中包括37個直接作用靶標和27個間接作用靶標。FKQJ主要是與酶、蛋白等結合,通過激活RNA聚合酶II啟動子的轉錄、抑制凋亡等生物過程發(fā)揮抗炎作用,主要影響的信號通路TNF、凋亡、MAPK、T細胞受體等。針對效應細胞富集結果表明,FKQJ抗炎靶標在巨噬細胞、中性粒細胞和漿細胞中顯著富集(p0.01)。其中巨噬細胞是其抗炎的主要效應細胞,而巨噬細胞浸潤是慢性炎癥的主要特點。綜合上述分析,可以初步得出如下結論:FKQJ用于治療慢性炎癥應有較好的療效,其抗炎主要效應細胞是巨噬細胞,主要作用靶標包括PGH2、NOS2等蛋白酶以及IL-1β、IL-6和TNFα等炎性因子,主要作用通路包括TNF信號通路、NOD樣受體信號通路以及Toll樣受體信號通路等。該結果為后續(xù)開展FKQJ質(zhì)量生物評價研究提供生物學指標選擇依據(jù)。利用代謝組學技術,篩選FKQJ藥物作用的生物標志物。以RAW264.7細胞為載體,采用LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激建立細胞炎癥模型,考察FKQJ對于在炎癥刺激下的單核巨噬細胞RAW264.7代謝產(chǎn)物的變化,結果表明:模型組、正常組、模型給藥組代謝輪廓區(qū)分明顯,提示FKQJ對小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的代謝行為影響較大。FKQJ的抗炎作用機制可以主要通過調(diào)節(jié)與炎癥、氨基酸代謝和能量代謝有關的途徑來實現(xiàn),其中,炎癥相關通路主要影響了花生四烯酸的新陳代謝,并影響到前列腺素類標志物的產(chǎn)生,它的機制與酶的抑制有關。代謝組學研究結果提示,COX-2可以作為FKQJ質(zhì)量生物評價的重要候選指標。2.采用點面結合的方法,分別單一靶點(酶水平)和基因表達譜(細胞水平)評價FKQJ的抗炎生物活性首次優(yōu)化了基于抑制COX-2酶活性的抗炎生物效價檢測方法。通過優(yōu)化環(huán)氧化酶-2抑制效價檢測試劑盒,提高檢測效果,并通過應用加以驗證。對試劑盒相關實際試劑用量和使用參數(shù)的優(yōu)化,明確了試劑盒的可使用限和不可使用限。孵育時間為5min時檢測結果更加理想;反復凍融次數(shù)不宜過多,最好不要超過6次;長時間貯藏應選擇-20°C,未用完的試劑放回-20°C不影響使用效果,提高了試劑盒的使用率;待測抑制及的配制溶劑也會影響試劑盒的使用效果,一般選擇DMSO,檢測效果更好,但是并不是適用所有抑制劑的特點,要根據(jù)抑制劑具體問題具體分析。考察了底物、酶和輔助因子的用量對抑制COX-2活性影響確定其合適用量。通過方法學考察,明確了該方法精密度高(日內(nèi)RSD=5.13%,日間RSD=6.56%),重復性(RSD=7.88%)好,方便重現(xiàn)(RSD=10.15%),可以滿足生物評價方法的要求酶用量對抑制COX-2活性影響。開發(fā)了一種基于基因表達譜來評價FKQJ抗炎生物活性的方法。以小鼠巨噬細胞RAW264.7為生物檢測器,在FKQJ處理24h后,使用內(nèi)含有30個抗炎指標性基因引物的基因芯片和qRT-PCR篩選能夠代表藥物生物活性的m RNA作為指標基因。并利用KEGG對篩選結果進行了通路富集分析。結果提示,FKQJ刺激Toll-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、TNF signaling pathway發(fā)生顯著下調(diào),但其對三條通路的作用側重點有所不同,FKQJ主要是下調(diào)了TLR4-NF-κB-TLR2以使Toll-like receptor signaling pathway下調(diào)。在TNF信號通路中,FKQJ主要集中在下調(diào)TNF-α、IL-6、COX-2、iNOS的表達而發(fā)揮抗炎作用,初步驗證了前面的網(wǎng)絡藥理學、代謝組學研究的預測結果。采用超高效液相色譜法(UPLC),測定了FKQJ中綠原酸、阿魏酸、染料木苷、藥根堿、穿心蓮內(nèi)酯、巴馬汀、小檗堿、脫水穿心蓮內(nèi)酯和藁本內(nèi)酯9種成分含量測定方法,并建立了化學指紋圖譜。測定結果表明,20批次的FKQJ化學指紋圖譜相似度較高,但是9個活性成分的含量存在較大差異,批次間各成分的變異系數(shù)分別為11.34%(綠原酸)、19.14%(阿魏酸)、20.19%(染料木苷)、30.79%(藥根堿)、18.19%(穿心蓮內(nèi)酯)、16.43%(巴馬汀)、36.88%(小檗堿)、29.02%(脫水穿心蓮內(nèi)酯)、16.84%(藁本內(nèi)酯),提示在實際生產(chǎn)過程中,要注意控制小檗堿、藥根堿等含量變化。從COX-2抑制的抗炎生物活性來看,藁本內(nèi)酯、巴馬汀與抗炎活性之間存在著顯著的相關性,說明藁本內(nèi)酯和巴馬汀含量越高,對COX-2酶活性對的抑制活性也性高。提示藁本內(nèi)酯和巴馬汀可能是FKQJ發(fā)揮抗炎作用的有效成分,在實際生產(chǎn)的質(zhì)量控制中,應增加對這類化學成分的檢測,從而確保質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性,更好的助力FKQJ的質(zhì)量控制。為了彌補單一質(zhì)量指標性成分對的整體質(zhì)量控制方面的不足,開展關聯(lián)臨床療效和作用機制的生物評估方法的研究,擬定了質(zhì)量標準。綜上所述,本文以FKQJ的抗炎活性為出發(fā)點,探討建立與臨床療效和作用機制有關的中藥質(zhì)量生物學評價方法,找出有效成分和指標,建立新的標準。該方法為中藥復方制劑的質(zhì)量控制和評價提供了新的思路和技術參考。由于時間和精力有限,FKQJ質(zhì)量生物學評價方法和標準仍然不夠,研究團隊將進一步驗證和優(yōu)化。
【圖文】：

產(chǎn)工藝和標準生產(chǎn)的制劑。它體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀念和辨證論治思想，是中國傳思想與現(xiàn)代技術量標準進工藝的結合產(chǎn)物。近年來，中藥和中藥復方制劑的質(zhì)量發(fā)展已經(jīng)取得不錯的成就，但是，放全國，其質(zhì)控現(xiàn)狀依然令人擔憂。現(xiàn)在的質(zhì)量控制方法和模式難以關聯(lián)其臨床效和作用機制，也難以表達中藥及中藥復方制劑的內(nèi)在質(zhì)量，這也是制約質(zhì)量控發(fā)展的關鍵問題(圖 1)�，F(xiàn)行的關于中藥復方制劑質(zhì)量標準包括《中國藥典》、部頒標準、地方標等，，大多是在顯微、薄層鑒別的基礎上，加上個別指標性成分的定性定量分析為質(zhì)量控制手段，然而中藥復方制劑化學成分更加復雜，大部分成分藥效與毒作用尚未完全闡明，且經(jīng)過復方配伍成分之間的協(xié)同和拮抗作用更為多樣，僅測一個或幾個化學成分并不能完全反應復方制劑的整體療效和安全性，還存在為。因此，建立中藥復方制劑新的質(zhì)量評控模式及方法已成為中藥復方制劑質(zhì)控制面臨的重大挑戰(zhàn)之一。

圖 3 中藥與生物藥、化學藥生產(chǎn)質(zhì)量控制模式的合理性Fig. 3 The rationality of quality control model for chinese medicine, biological medicine andchemical medicine生物檢定是在嚴格控制的試驗條件下，以藥物的藥理作用為基礎，以生物測定學為工具，采用特定的實驗設計，對使用生物體（整個動物、體外組織、器官、細胞、微生物等）的藥物的生物活性（包括功效和毒性）對藥物進行評估的一種方法[2]，通過比較供試品產(chǎn)生的特定反應和等效標準來評估藥物的效力或毒性[3-4]。該方法的應用尚不清楚該藥物的有效成分，或該有效成分的結構復雜，常規(guī)化學定量方法無法測定該藥物，或其含量不能真實反映其臨床療效的藥物具有重要意義。從生物評價發(fā)展來看（圖 4），中藥的生物評價方法歷史淵源。進入 21 世紀后，科技不斷進步和發(fā)展，人們的質(zhì)控意識逐步增強，對中藥化學評價的局限
【學位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R286.0

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本文編號：2613278