【摘要】：藥桑是生長(zhǎng)于我國(guó)新疆的一種黑桑,是具有最高染色體倍性的桑樹資源。藥桑椹含有豐富的花青素、黃酮等成分,是維族治療扁桃腺炎、咽喉腫痛等疾病的傳統(tǒng)維藥,具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤等活性。炎癥是機(jī)體因機(jī)械損傷、細(xì)菌或病毒感染、有毒藥物等損害因子引起,多細(xì)胞、多因子參與的復(fù)雜免疫防御過程。其基本癥狀包括紅、熱、腫、痛,是人類疾病中一種最常見的基本病理過程。炎癥一般可分為急性和慢性炎癥,一方面,急性炎癥是機(jī)體的一種防御保護(hù)機(jī)制,可有效阻止感染和損傷的惡性發(fā)展;另一方面,炎癥反應(yīng)過度或慢性長(zhǎng)期性炎癥的持續(xù)會(huì)對(duì)機(jī)體造成或重或輕的損害。如咽喉炎所致的疼痛,藥物過敏危及生命,膽固醇增加和血栓形成,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛等。目前市場(chǎng)上使用的甾體及非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥物都有一定的毒副作用,每年因此受到影響的炎癥藥物使用者超過百萬計(jì)。因此,研制天然無毒副作用的抗炎藥物,對(duì)慢性或持續(xù)性炎癥進(jìn)行控制具有重要意義。本研究首先使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化得到了藥桑椹總黃酮(MnTF)的最佳提取工藝。同時(shí),我們開發(fā)了新的超高效液相連用紫外和質(zhì)譜(UPLC-TUV/QDa)方法,對(duì)主要黃酮類成分進(jìn)行鑒定分析,并檢測(cè)分析了26個(gè)種質(zhì)資源桑椹的總黃酮(TF)、花青素、黃酮醇的含量和分布情況,分析了不同成熟度藥桑的花青素和黃酮醇含量的變化趨勢(shì),根據(jù)成分分布和果色對(duì)桑椹進(jìn)行分型。進(jìn)而我們比較分析了黑桑與非黑桑在黃酮成分上的差異,通過毒性和抗炎鎮(zhèn)痛評(píng)估、細(xì)胞因子檢測(cè)、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)量分析、抗氧化抗菌活性分析,對(duì)黑桑和非黑桑的抗炎鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行比較研究,并探究其主要抗炎鎮(zhèn)痛活性物質(zhì)和抗炎作用通路。主要結(jié)果如下:1、MnTF提取工藝優(yōu)化利用6因素2水平的正交試驗(yàn),篩選得到?jīng)Q定MnTF提取率的3個(gè)主要因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取次數(shù)。通過單因素試驗(yàn)及3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得MnTF的最佳提取條件:48%乙醇、溫度80℃、重復(fù)提取4次。MnTF得率預(yù)測(cè)為2.32%,實(shí)測(cè)2.31%。進(jìn)一步比較了不同提取方案對(duì)MnTF的提取率、抗氧化活性(包括還原力、羥自由基和超氧陰離子自由基清除力)、實(shí)際效率和效益后,確定MnTF的最優(yōu)提取方案為:38%乙醇、60℃重復(fù)提取2次、15 min/次、料液比1∶10、超聲功率500 W,MnTF得率為2.22%。2、26個(gè)資源桑椹的TF、花青素、黃酮醇測(cè)定分析通過新建立的UPLC-TUV/QDa方法可對(duì)桑椹中主要黃酮類化合物,包括3種花青素和5種黃酮醇快速定性定量分析。對(duì)26個(gè)桑椹資源的調(diào)查顯示:藥桑椹含有豐富的黃酮類化合物,并且TF(35.39 mg/g)、矢車菊素-3-O-葡糖苷(C3G,8.29 mg/g)、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷(C3R,2.89 mg/g)和槲皮素(Qu,74.44μg/g)含量是26個(gè)資源中最高的。通過對(duì)不同果色或成熟度的藥桑椹成分分析發(fā)現(xiàn),在桑椹紅變黑的時(shí)期,花青素含量急速升高,大部分果色變黑后,花青素含量又逐漸下降,而整個(gè)桑椹發(fā)育成熟階段,黃酮醇成分含量都較低,但蘆丁在這一時(shí)期含量逐漸升高。不同果色桑椹的花青素和黃酮醇含量存在明顯差異,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),桑椹顏色越深其花青素和黃酮醇含量越高。這些桑椹通過主成分分析(PCA)和顏色比較主要可分為3類:一是黑桑椹,花青素和黃酮醇含量豐富,顏色紫黑,代表為藥桑、紅果2號(hào)等;二是紅或紅黑混色桑椹,花青素和黃酮醇含量中等,代表為蒙桑、臺(tái)灣長(zhǎng)果桑等;三是白果桑椹,不含或少量含有花青素,黃酮醇含量較少,代表為珍珠白、白玉王等。3、黑桑(藥桑)與非黑桑(蒙桑和珍珠白)抗炎、鎮(zhèn)痛和抗菌活性的比較及其機(jī)理研究比較分析了黑桑總黃酮(MnTF)和非黑�？傸S酮(包括蒙古桑總黃酮MmTF和珍珠白總黃酮MazTF)的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗菌活性。MnTF花青素達(dá)11.43 mg/g,黃酮醇0.70 mg/g,相比之下,MmTF和MazTF的黃酮醇含量較低,MazTF則不含花青素。通過對(duì)小鼠體重的監(jiān)測(cè)和RAW264.7細(xì)胞活力的測(cè)定試驗(yàn)表明,三種桑椹總黃酮(TFs)都沒有毒副作用。通過福爾馬林誘導(dǎo)小鼠腳趾疼痛試驗(yàn)、二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹試驗(yàn)和角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠腳趾水腫試驗(yàn)證明,MnTF相對(duì)于MmTF和MazTF具有更出色的鎮(zhèn)痛和消腫活性,MnTF的鎮(zhèn)痛消腫作用呈劑量依賴性增強(qiáng)。采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中促炎細(xì)胞因子白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)和一氧化氮(NO)水平表明,MnTF(50、100 mg/kg)可顯著抑制或清除這些細(xì)胞因子。在蛋白水平上,MnTF可顯著抑制炎癥關(guān)鍵蛋白誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化物酶2(COX2)、磷酸化p65(p-p65)和磷酸化IκBα(p-IκBα)的表達(dá),并增加抗炎因子白介素-10(IL-10)的表達(dá)。通過單體化合物的小鼠鎮(zhèn)痛試驗(yàn)證明,C3G、蘆丁(Ru)和異槲皮素(IQ)3種主要桑椹黃酮具有顯著鎮(zhèn)痛活性。同時(shí),MnTF顯示良好的還原力和自由基(OH~-,O_2~-,DPPH和ABTS)清除活性,這可能是其良好抗炎鎮(zhèn)痛活性的基礎(chǔ)。通過對(duì)致炎性細(xì)菌,包括大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌試驗(yàn)證明,MnTF的抗菌活性顯著高于MmTF和MazTF,MnTF對(duì)上述三種疾病的最小殺菌濃度(MBC)分別為2、2、1.8 mg/mL。綜上所述,本研究?jī)?yōu)化了MnTF的提取工藝,采用UPLC-TUV/QDa鑒定到桑椹中主要有3種花青素和5種黃酮醇。進(jìn)一步檢測(cè)分析了26個(gè)種質(zhì)資源桑椹的總黃酮、花青素、黃酮醇的含量分布情況,根據(jù)成分分布和顏色差異確定桑椹主要類型可分為黑、紅、白三色桑椹。進(jìn)而比較分析了黑桑與非黑桑的抗炎鎮(zhèn)痛活性。結(jié)果表明MnTF相對(duì)MmTF和MazTF具有更出色的鎮(zhèn)痛、消腫和抗菌活性,這些特性與其所含豐富的花青素(C3G和C3R)和黃酮醇(Ru),以及其對(duì)炎癥細(xì)胞因子、iNOS、COX2和核因子-κB(NF-κB)途徑相關(guān)蛋白的抑制作用密切相關(guān)。
【圖文】：

研究進(jìn)展原酮，是一類擁有 C6-C3-C6 基央吡喃環(huán)（C 環(huán)）氧化水平和兩型的黃酮化合物[9,10]，如黃酮、[11]。自然界中，黃酮類化合物主單糖、雙糖、三糖和�；牵�、位苷固體多是無定形粉末，其余則軛體系，，以電子轉(zhuǎn)移和重排延長(zhǎng)了黃酮苷常能與強(qiáng)極性溶劑水、乙醇有機(jī)溶劑，黃酮苷的糖苷鏈越長(zhǎng)則不緊密，分子間引力降低而有利于有多個(gè)酚羥基，故呈酸性，酚羥基

圖 3.1 標(biāo)準(zhǔn)品曲線Fig. 3.1 Standard curve各因素正交水平，設(shè)計(jì) L8(27)正交試驗(yàn)，結(jié)果表 3.2 L8(27)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3.2 Design and results of L8(27) orthogonal arB C D E F 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 1 1 2 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 2 2 1 2 1 % 7.77% 7.60% 7.37% 7.85% 7.40%
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2610441