發(fā)布時間：2020-03-31 22:45

【摘要】：選題依據(jù):遠志是我國重要的大宗藥材之一,具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫之功效。皂苷類物質(zhì)是遠志發(fā)揮安神益智作用的主要活性成分,非常適合開發(fā)成為抗衰老及腦保護的新藥。但有兩個方面的因素制約著遠志皂苷的商品開發(fā)。從遠志資源方面講,上世紀80年代起,遠志藥材逐漸從野生生長過渡為人工種植,由于沒有規(guī)范化的種植管理模式,其目前面臨著幾個問題:遠志屬植物品種繁多,我國有遠志屬植物42種8變種,廣泛分布于東北、華北、西北和華中以及四川等地,且古代多個品種均可入藥;沒有商品化的種子;在人工種植過程中,壯根靈等過度使用。這些使遠志藥材質(zhì)量不均一,種質(zhì)逐漸退化。從獲得難易方面講,遠志皂苷苷元種類多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,且化合物中手性中心多,導(dǎo)致單個苷元衍生出的皂苷結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜繁多,從而使其單體難以從植物中分離純化;用化學(xué)合成手段得率又不高。這些均限制了遠志皂苷開發(fā)成為腦保護的新藥。天然產(chǎn)物的異源合成為遠志皂苷的開發(fā)提供了新思路,即通過研究遠志皂苷合成途徑中的催化酶,再將合成途徑導(dǎo)入微生物細胞,從而大量獲得天然產(chǎn)物或其前體。在這一過程中,研究參與遠志皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶顯得至關(guān)重要。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CYP716A249可能以β-香樹脂醇為底物,催化其生成遠志皂苷苷元齊墩果酸。因此,本研究首先以釀酒酵母W303a為底盤菌,通過改造其內(nèi)源基因、引入外源β-AS基因,得到高產(chǎn)β-香樹脂醇的釀酒酵母細胞,為CYP716A249的功能驗證提供底物。再構(gòu)建產(chǎn)齊墩果酸的酵母工程菌,為遠志皂苷后續(xù)CYP450酶的功能驗證提供平臺。然后對CYP716A249的生物信息學(xué)及其在不同生長年限遠志的不同組織中mRNA表達水平進行分析,得到CYP716A249的基本概況。最后以產(chǎn)β-香樹脂醇的酵母細胞為底盤菌,對CYP716A249的功能進行驗證。這進一步推動了遠志皂苷生物合成途徑的闡明,并為遠志皂苷的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。目的:1.構(gòu)建高產(chǎn)β-香樹脂醇的酵母工程菌,為遠志CYP716A249的功能驗證提供底物。2.構(gòu)建產(chǎn)齊墩果酸的酵母工程菌,為遠志皂苷后續(xù)CYP450酶的功能驗證提供平臺。3.驗證遠志CYP716A249的功能。方法:1.通過酶切連接法構(gòu)建tHMGR、ERG20過表達載體,采用同源重組及重疊延伸PCR(OE-PCR)技術(shù)構(gòu)建光果甘草GgbAS表達載體,采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法將3個載體轉(zhuǎn)入酵母細胞W303a中,使酵母中引入外源β-AS基因同時內(nèi)源基因得到調(diào)控,最終獲得高產(chǎn)β-香樹脂醇的釀酒酵母細胞。2.采用酶切連接法及OE-PCR技術(shù),構(gòu)建苜蓿OAS聯(lián)合百脈根CPR(MtOAS-CPR)的表達載體,轉(zhuǎn)入產(chǎn)β-香樹脂醇的酵母細胞,LC-MS檢測齊墩果酸產(chǎn)量,得到產(chǎn)齊墩果酸的酵母工程菌。3.運用軟件DNAstar、MEGA 5.1及https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/、http://web.expasy.org/protparam/、https://www.genscript.com/psort.html、http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search、http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站提供的在線分析工具,對遠志CYP716A249的核苷酸序列及氨基酸序列進行分析;通過熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)分析CYP716A249在不同生長年限遠志的不同組織中mRNA表達水平。4.采用酶切連接法及OE-PCR技術(shù),構(gòu)建遠志CYP716A249聯(lián)合百脈根CPR(PtOAS-CPR)的表達載體,轉(zhuǎn)入產(chǎn)β-香樹脂醇的酵母細胞,LC-MS檢測代謝物中有無齊墩果酸生成,從而鑒定CYP716A249的功能。結(jié)果:1.構(gòu)建了tHMGR、ERG20、GgbAS的過表達載體。酵母中轉(zhuǎn)入GgbAS可使其產(chǎn)生1.98 mg/L的β-香樹脂醇;調(diào)控ERG20使β-香樹脂醇的產(chǎn)量升高了1.19倍,為4.35 mg/L;同時調(diào)控tHMGR及ERG20則使β-香樹脂醇產(chǎn)量升高4.3倍,為10.51mg/L。2.構(gòu)建了MtOAS-CPR表達載體,轉(zhuǎn)入產(chǎn)β-香樹脂醇的酵母中,齊墩果酸的產(chǎn)量為1.30 mg/L。得到產(chǎn)齊墩果酸的釀酒酵母工程菌。3.通過軟件及在線工具,分析及預(yù)測CYP716A249的序列及功能,得出CYP716A249為親水性蛋白,不穩(wěn)定,主要存在于線粒體上,在遠志中極有可能為催化β-香樹脂醇生成齊墩果酸的酶。RT-qPCR結(jié)果得出,CYP716A249在二年生遠志根中的表達量最高。4.構(gòu)建了PtOAS-CPR表達載體,轉(zhuǎn)入產(chǎn)β-香樹脂醇酵母工程菌,可檢測出有齊墩果酸生成。得出CYP716A249為遠志中的齊墩果酸合酶(OAS),可以β-香樹脂醇為底物生成齊墩果酸。結(jié)論:本研究以釀酒酵母作為底盤菌,構(gòu)建了產(chǎn)β-香樹脂醇及齊墩果酸的酵母工程菌,并對遠志中的齊墩果酸合酶CYP716A249進行功能鑒定,推進了遠志皂苷生物合成途徑的闡明,加快了遠志皂苷在酵母體內(nèi)異源合成的步伐,為遠志皂苷的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

遠志與卵葉遠志圖（A：《中華大典·醫(yī)藥衛(wèi)生典·藥學(xué)分典·藥物圖錄總部墨線圖卷》；B、C：《中華本草》）

遠志皂苷生物合成關(guān)鍵酶 CYP716A249 在釀酒酵母中的功能鑒定國東北、華北、西北等地，主產(chǎn)于山西、陜西、河北、山東、河南等地，且山西、陜西產(chǎn)量大，，供應(yīng)全國，并以山西產(chǎn)品質(zhì)量佳，奉為道地藥材，習(xí)稱“關(guān)遠志”[23]。趙云生等[24]對遠志資源進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)山西遠志年銷售量達到 1000 余噸，占全國總銷售量的 50%以上，成為重要的遠志種植、加工、購銷集散地。綜上所述，古代本草記載遠志最早發(fā)現(xiàn)產(chǎn)于山東，后在河南、陜西等地也有發(fā)現(xiàn)，且認為河南開封產(chǎn)的遠志品質(zhì)較優(yōu)良。在宋代的《圖經(jīng)》中，發(fā)現(xiàn)山西出產(chǎn)遠志（圖 2.3 為遠志產(chǎn)地變遷圖）。因隨著臨床需求的日益增多，遠志的野生資源逐漸減少，20 世紀 80 年代，對遠志進行了引種栽培，并逐漸形成了以陜西合陽與山西新絳為主的遠志栽培基地。經(jīng)走訪調(diào)研安國、亳州、荷花池等地的藥材市場，發(fā)現(xiàn)市面所售遠志 80%為山西產(chǎn)遠志，且大量近現(xiàn)代文獻均表明山西的遠志產(chǎn)量大、品質(zhì)佳。又因遠志多生長于川谷及河岸，而山西運城地處黃河沿岸，位于中條山下，較適宜遠志的生長。最終，本文認為山西為現(xiàn)今遠志 P. tenuifolia Willd.的道地產(chǎn)區(qū)。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284;Q78

【參考文獻】

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本文編號：2609672