【摘要】：目的:探索朱砂與HgS、HgCl_2、MeHg腎臟的攝入和外排的差異。方法:1、建立UPLC-ICP/MS定量分析方法,以檢測HEK 293T細胞內(nèi)外無機汞和甲基汞含量變化。2、HEK 293T細胞種于96孔板中,設(shè)置空白對照組、HgCl_2組(0.2μM)、MeHg組(0.2μM)、HgS組(0.2μM)、朱砂組(0.2μM)5個實驗組,每組6孔。各供試品經(jīng)前處理后,分別與細胞孵育48h后,在避光條件下加入20μL MTT,4h后小心吸出上清后加入150μL DMSO,在490 nm波長處檢測吸光度值。3、HEK 293T細胞種于6孔板中,設(shè)置空白對照組、HgCl_2組(0.2μM)、MeHg組(0.2μM)、HgS組(0.2μM)、朱砂組(0.2μM)5個實驗組,每組6孔。各供試品經(jīng)前處理后,分別與細胞孵育24h、36h、48h后,用PBS清洗并輕輕吹打細胞后收集于2 mL離心管中,室溫下179×g,離心3 min。重復以上操作兩次后,收集細胞內(nèi)汞樣本(加入2 mL 0.3%Triton X-100,常溫下靜置10 min后,取出),檢測細胞內(nèi)汞含量。4、HEK 293T細胞種于6孔板中,設(shè)置空白對照組、HgCl_2組(0.2μM)、MeHg組(0.2μM)、HgS組(0.2μM)、朱砂組(0.2μM),每組6孔。各供試品經(jīng)前處理后與細胞孵育48h后,用PBS清洗3次,加入含9%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基再繼續(xù)分別培養(yǎng)24h、36h(共孵育培養(yǎng)72h、84h)。收集細胞外液(即培養(yǎng)基),檢測細胞外汞含量。5、將HEK 293T細胞接種于6孔板中,設(shè)置空白對照組、HgCl2組(0.2μM)、MeHg組(0.2μM)、HgS組(0.2μM)、朱砂組(0.2μM),每組6孔。各供試品經(jīng)前處理后與細胞分別孵育24h、36h、48h,用PBS清洗三次后,每孔加入1 mL Trizol裂解細胞。同樣將HEK 293T細胞接種于6孔板中,設(shè)置空白對照組、HgCl2組(0.2μM)、MeHg組(0.2μM)、HgS組(0.2μM)、朱砂組(0.2μM),每組6孔。各供試品經(jīng)前處理后與細胞孵育48h后,用PBS清洗3次后,每孔加入1 mL Trizol裂解細胞。用Real-Time PCR法檢測腎臟轉(zhuǎn)運體mRNA的表達。結(jié)果:1、建立了快速、準確、靈敏的UPLC-ICP/MS定量分析檢測方法,可以滿足檢測細胞內(nèi)外無機汞以及甲基汞濃度變化的要求。2、給予同等摩爾質(zhì)量的氯化汞、甲基汞、硫化汞、朱砂(0.2μM)后,MTT實驗表明細胞存活率分別為90.97%,90.32%,91.88%,91.45%。3、細胞內(nèi)汞實驗表明,24h細胞內(nèi)氯化汞組中無機汞含量為0.48%(占加入量的百分比),而硫化汞、朱砂組中無機汞的含量則低于0.039μg/L(定量下限為0.039μg/L)。甲基汞組中有機汞含量為8.43%(占加入量的百分比),而24h細胞內(nèi)硫化汞和朱砂組中有機汞的含量則低于0.039μg/L(定量下限為0.039μg/L)。36h細胞內(nèi)氯化汞組、硫化汞組、朱砂組中無機汞含量分別為2.41%、1.58%、0.36%(占加入量百分比)。甲基汞組、硫化汞組、朱砂組中有機汞的含量為10.31%、0.77%、0.14%(占加入量百分比)。48h氯化汞組、硫化汞組、朱砂組中細胞內(nèi)無機汞的含量為3.00%、2.40%、2.20%(占加入量百分比)。48h細胞內(nèi)甲基汞組、硫化汞組、朱砂組中有機汞的含量為15.38%、0.79%、0.19%(占加入量百分比)。結(jié)果表明,隨著時間的增加,朱砂組和硫化汞組細胞內(nèi)汞無機汞含量不斷增加,并在48h時達到高峰且其入胞速度遠低于氯化汞和甲基汞組。4、細胞外汞實驗表明,24h(共孵育培養(yǎng)72h)細胞外氯化汞組、硫化汞組、朱砂組中無機汞的含量為68.28%、74.01%、81.35%(占細胞內(nèi)汞含量百分比)。24h細胞外甲基汞組、硫化汞組、朱砂組中有機汞的含量為63.55%、1.06%、1.14%(占細胞內(nèi)汞含量百分比)。36h(共孵育培養(yǎng)84h)細胞外氯化汞組、硫化汞組、朱砂組中無機汞的含量為71.80%、81.17%、89.02%(占細胞內(nèi)汞含量百分比),84h細胞內(nèi)甲基汞組、硫化汞組、朱砂組中有機汞的含量分別為66.96%、1.34%、1.40%(占細胞內(nèi)汞含量百分比)。結(jié)果表明,在84h時朱砂組無機汞的外排含量最多。5、在24h、36h以及48h時朱砂組、硫化汞組、氯化汞組以及甲基汞組對攝入轉(zhuǎn)運體Cnt2以及Octn1的m RNA幾乎沒有影響。在72h時硫化汞和朱砂組組使Mdr1的mRNA的表達顯著增加,朱砂組和硫化汞組分別在72h和48h時使Mrp2的mRNA水平增高。而甲基汞組和氯化汞組對Mrp1、Mrp2、Mrp4 mRNA水平幾乎沒有影響。結(jié)論:1、朱砂和其他含汞化合物的轉(zhuǎn)運不同,且其入胞速度遠低于HgCl_2和MeHg,出胞速度較HgCl_2和MeHg快。2、HgS和朱砂的外排可能與腎臟轉(zhuǎn)運體Mdr1、Mrp2有關(guān)。
【圖文】：

17圖 1 細胞內(nèi)汞無機汞和甲基汞色譜圖 (A：空白組 B：標準品溶液 C: 朱砂組 D: 硫化汞組 E：氯化汞組 F: 甲基汞組，1：無機汞、2：甲基汞、3：金）Fig. 1 Representive chromatograms of inorganic mercury and methyl mercury in cellsamples(A: the blank group, B: the standard control group, C: the cinnabar group, D: themercuric sulfide group, E: the mercuric chloride group, F: the methyl mercury group, 1:Methyl mercury, 2: Inorganic mercury, 3: Au )

碩士學位論文 準曲線的制備為橫坐標，峰面積縱坐標，計算回歸方程；細胞內(nèi)0 μg/L 范圍標準曲線：y=39312.5656 x+1700.5078，r=0.92.500 μg/L 范圍標準曲線：y=18657.4264 x+ -645.4927，，r=濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖 3 所示：
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2607761