【摘要】：背景:艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS,Acquired Immune Deficiency Syndrome),是一種由于感染I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1,Human Immunodeficiency Virus type 1)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能完全喪失的傳染性疾病。國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)的數(shù)據(jù)顯示,2016年我國(guó)現(xiàn)存AIDS患者約62萬(wàn)人,這為公眾健康以及社會(huì)穩(wěn)定帶來(lái)了巨大的隱患。AIDS的治療一直是世界性的難題。目前臨床上主要使用逆轉(zhuǎn)錄抑制劑、整合酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等,但是當(dāng)前的治療方法不能完全消滅病毒治愈艾滋病。并且當(dāng)前的抗病毒治療容易產(chǎn)生耐藥性和嚴(yán)重的毒副作用限制了其發(fā)展,因此研制安全有效的HIV-1疫苗是HIV的預(yù)防和控制新的方向。HIV-1病毒具有高突變和基因重組多樣的特點(diǎn),HIV疫苗的研究面臨巨大的困難與挑戰(zhàn)。CCR5(The C-C chemokine receptor type 5)受體是臨床現(xiàn)有HIV-1毒株必不可少的共受體之一,是導(dǎo)致全球HIV-1病毒株傳播的主要共受體,使得它可以作為抗病毒治療的重要靶點(diǎn)。CCR5作為宿主細(xì)胞中的固有受體,在HIV感染中發(fā)揮重要作用并且保守性較強(qiáng),十分適合作為抗HIV-1研究的切入點(diǎn)。本研究中針對(duì)CCR5受體主要做了兩方面的工作,一方面通過(guò)添加中藥提取物至穩(wěn)定表達(dá)CCR5的細(xì)胞系中,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CCR5蛋白在藥物作用下的表達(dá)情況,從而判斷體外添加中藥提取物對(duì)CCR5受體的作用以及抗HIV-1的活性;另一方面主要采用哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng),研究抗HIV-1中和抗體PRO140與宿主細(xì)胞CCR5基因的相互作用,為進(jìn)一步的作用于CCR5分子抗體的篩選和研究打下基礎(chǔ)。目的:研究體外狀態(tài)下中藥提取物對(duì)CCR5蛋白表達(dá)的影響,從而判斷該中藥是否具有潛在的抗HIV-1活性;構(gòu)建含有中和抗體基因的質(zhì)粒pVP16-PRO140,將重組質(zhì)粒與含有CCR5的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中,通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因來(lái)分析,兩個(gè)蛋白是否有相互作用,為進(jìn)一步抗體方面的研究打下基礎(chǔ)。方法:1.添加中藥提取物至穩(wěn)定表達(dá)CCR5蛋白的細(xì)胞系,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CCR5表達(dá)受到中藥提取物的影響情況。2.采用質(zhì)粒提取、酶切、膠回收的方法獲取目的片段PRO140,并將其插入載體pVP16內(nèi),構(gòu)建重組質(zhì)粒p VP16-PRO140,通過(guò)菌落PCR、酶切電泳分析及測(cè)序的方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。3.同樣采用分子克隆的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pM-CCR5,并應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。將重組質(zhì)粒pM-CCR5及空載體pM轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中,然后使用Western Blot的方法從蛋白水平檢測(cè)CCR5基因的表達(dá)。4.通過(guò)哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng),共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pVP16-PRO140和質(zhì)粒pM-CCR5以及報(bào)告基因到CHO細(xì)胞中。5.使用分泌型堿性磷酸酶檢測(cè)來(lái)鑒定PRO140抗體與CCR5受體之間相互作用效果。結(jié)論:1.在體外實(shí)驗(yàn)中,中藥提取物穿心蓮內(nèi)酯和槲皮素均可以不同程度的抑制CCR5蛋白的表達(dá),而蘆丁、白術(shù)等提取物對(duì)CCR5蛋白的表達(dá)無(wú)明顯作用。2.初步構(gòu)建哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng),并驗(yàn)證了CCR5蛋白與單鏈抗體PRO140的相互作用,證明該系統(tǒng)可以用于檢測(cè)CCR5蛋白與目標(biāo)蛋白是否有相互作用,進(jìn)行靶向CCR5受體的抗體藥物的篩選。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2606125