【摘要】：目的:驗證長白山人參水煎液中miRNA是否存在;驗證空白組(正常大鼠)和處理組(灌胃人參水煎液)大鼠血液中人參miRNA的表達變化;通過建立氣虛疲勞大鼠模型,驗證人參miRNA對其靶基因的影響。方法:1.選用通用植物miRNA提取試劑盒法抽提人參水煎液miRNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠、Agilent2100 Bioanalyzer檢測其質(zhì)量、純度、完整性。并利用Illumina HiSeq ~TMM 2500測序儀對人參水煎液進行測序分析,預(yù)測其中是否存在已知miRNA以及新的miRNA,以及利用RT-qPCR技術(shù)驗證已知miRNA。2.6只大鼠分成2組(空白組和處理組),每組各3只,除正常組外,處理組灌胃2次/天,灌胃體積均為1ml/100g,連續(xù)給藥30天。第31天,不給藥,取各組血液,采用HiPure Liquid RNA/miRNA Kit試劑盒進行血液RNA的提取,利用RT-qPCR技術(shù)檢測驗證大鼠血液中含有的人參miRNA,以及通過生物信息學方法將測序得到的人參煎液中miRNA比對大鼠進行靶基因分析篩選。3.60只大鼠分成6組(人參水煎液組-R、去人參miRNA組-Q、人參miRNA組-M、人參皂苷組-Z、PBS組-P和空白組-K),每組10只,采用飲食失節(jié)+力竭游泳方法制造氣虛疲勞大鼠模型,連續(xù)20天。第21天,給藥,不游泳,取各材,測血清BUN、LDH和肝糖原的含量。并觀測各組藥物對大鼠的影響,通過RT-qPCR驗證人參miRNA是否影響氣虛疲勞大鼠免疫基因的表達變化。結(jié)果:1.利用瓊脂糖凝膠和Agilent2100 Bioanalyzer檢測,人參水煎液能有效提取miRNA。通過測序,最終鑒定人參煎液有71個miRNA家族。利用RT-qPCR驗證人參水煎液中miR159、miR167、miR396、miR166、miR168、miR156、miR165、miR162、miR394均存在并表達量降低。2.利用RT-qPCR技術(shù)進一步地驗證大鼠血液中確實存在人參miRNA,如miR159、miR167、miR393、miR156、miR8175、miR5072等。并通過靶基因預(yù)測的相關(guān)軟件分析,發(fā)現(xiàn)人參中的部分miRNA對大鼠部分基因能夠達到高度匹配。如miR159與Mmp9,miR167與Bcl2l1,miR8175與Il4r,miR5072與Bcl2,miR158與Mapk14等。3.通過各項指標驗證,發(fā)現(xiàn)本實驗成功建立氣虛疲勞大鼠模型。給予各組藥物后,RT-qPCR驗證得出人參miRNA組大鼠體內(nèi)的免疫基因表達量有明顯變化,人參miRNA能夠影響INF-8、IL10、MMP9、IL4R、MARK14、TNF-α、BCL2L1 mRNA的表達,其可能影響多條免疫應(yīng)答信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進而調(diào)節(jié)多種細胞因子的表達來防治氣虛證。結(jié)論:初次證實人參煎液中miRNA的存在,以及人參miRNA對氣虛疲勞大鼠機體免疫基因的調(diào)節(jié)作用,為我們提供了認識和研究人參的新途徑。從基因的層面深入揭示中醫(yī)藥療效的作用機制,同時也影響人參類新藥、保健品及相關(guān)用品的研究與開發(fā)。
【圖文】：

山人參水煎液 miRN成過程中兩端往往會被甲的影響。本部分實驗對新croRNA 快速提取試劑盒進RNA，并利用高通量測序?qū)⒅仓曩徸郧迤街兴幉氖续櫻愀苯淌阼b別為五加

圖 2-2 實驗流程圖 miRNA 高通量測序后的生物信息學分析學分析是經(jīng)過高通量測序后的必備步驟，本部分將對整準信息分析，，并預(yù)測 miRNA 的靶基因富集分析。標準個模塊:先，對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行處理，從而得到小 RN后，對獲得的小 RNAtag 序列進行注釋分析，通過注釋NA 的 tag 序列組成，從而鑒定出 mirna。后，分析 miRNA 表達譜對靶基因的富集、對 miRNA 對靶基因預(yù)測進行分析。其流程如下（見圖 2-3）：
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2605669