【摘要】：目的:驗(yàn)證長(zhǎng)白山人參水煎液中miRNA是否存在;驗(yàn)證空白組(正常大鼠)和處理組(灌胃人參水煎液)大鼠血液中人參miRNA的表達(dá)變化;通過(guò)建立氣虛疲勞大鼠模型,驗(yàn)證人參miRNA對(duì)其靶基因的影響。方法:1.選用通用植物miRNA提取試劑盒法抽提人參水煎液miRNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠、Agilent2100 Bioanalyzer檢測(cè)其質(zhì)量、純度、完整性。并利用Illumina HiSeq ~TMM 2500測(cè)序儀對(duì)人參水煎液進(jìn)行測(cè)序分析,預(yù)測(cè)其中是否存在已知miRNA以及新的miRNA,以及利用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證已知miRNA。2.6只大鼠分成2組(空白組和處理組),每組各3只,除正常組外,處理組灌胃2次/天,灌胃體積均為1ml/100g,連續(xù)給藥30天。第31天,不給藥,取各組血液,采用HiPure Liquid RNA/miRNA Kit試劑盒進(jìn)行血液RNA的提取,利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)驗(yàn)證大鼠血液中含有的人參miRNA,以及通過(guò)生物信息學(xué)方法將測(cè)序得到的人參煎液中miRNA比對(duì)大鼠進(jìn)行靶基因分析篩選。3.60只大鼠分成6組(人參水煎液組-R、去人參miRNA組-Q、人參miRNA組-M、人參皂苷組-Z、PBS組-P和空白組-K),每組10只,采用飲食失節(jié)+力竭游泳方法制造氣虛疲勞大鼠模型,連續(xù)20天。第21天,給藥,不游泳,取各材,測(cè)血清BUN、LDH和肝糖原的含量。并觀(guān)測(cè)各組藥物對(duì)大鼠的影響,通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證人參miRNA是否影響氣虛疲勞大鼠免疫基因的表達(dá)變化。結(jié)果:1.利用瓊脂糖凝膠和Agilent2100 Bioanalyzer檢測(cè),人參水煎液能有效提取miRNA。通過(guò)測(cè)序,最終鑒定人參煎液有71個(gè)miRNA家族。利用RT-qPCR驗(yàn)證人參水煎液中miR159、miR167、miR396、miR166、miR168、miR156、miR165、miR162、miR394均存在并表達(dá)量降低。2.利用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)一步地驗(yàn)證大鼠血液中確實(shí)存在人參miRNA,如miR159、miR167、miR393、miR156、miR8175、miR5072等。并通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)的相關(guān)軟件分析,發(fā)現(xiàn)人參中的部分miRNA對(duì)大鼠部分基因能夠達(dá)到高度匹配。如miR159與Mmp9,miR167與Bcl2l1,miR8175與Il4r,miR5072與Bcl2,miR158與Mapk14等。3.通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)成功建立氣虛疲勞大鼠模型。給予各組藥物后,RT-qPCR驗(yàn)證得出人參miRNA組大鼠體內(nèi)的免疫基因表達(dá)量有明顯變化,人參miRNA能夠影響INF-8、IL10、MMP9、IL4R、MARK14、TNF-α、BCL2L1 mRNA的表達(dá),其可能影響多條免疫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)防治氣虛證。結(jié)論:初次證實(shí)人參煎液中miRNA的存在,以及人參miRNA對(duì)氣虛疲勞大鼠機(jī)體免疫基因的調(diào)節(jié)作用,為我們提供了認(rèn)識(shí)和研究人參的新途徑。從基因的層面深入揭示中醫(yī)藥療效的作用機(jī)制,同時(shí)也影響人參類(lèi)新藥、保健品及相關(guān)用品的研究與開(kāi)發(fā)。
【圖文】：

山人參水煎液 miRN成過(guò)程中兩端往往會(huì)被甲的影響。本部分實(shí)驗(yàn)對(duì)新croRNA 快速提取試劑盒進(jìn)RNA，并利用高通量測(cè)序?qū)⒅仓曩?gòu)自清平中藥材市鴻雁副教授鑒別為五加

圖 2-2 實(shí)驗(yàn)流程圖 miRNA 高通量測(cè)序后的生物信息學(xué)分析學(xué)分析是經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序后的必備步驟，本部分將對(duì)整準(zhǔn)信息分析，，并預(yù)測(cè) miRNA 的靶基因富集分析。標(biāo)準(zhǔn)個(gè)模塊:先，對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而得到小 RN后，對(duì)獲得的小 RNAtag 序列進(jìn)行注釋分析，通過(guò)注釋NA 的 tag 序列組成，從而鑒定出 mirna。后，分析 miRNA 表達(dá)譜對(duì)靶基因的富集、對(duì) miRNA 對(duì)靶基因預(yù)測(cè)進(jìn)行分析。其流程如下（見(jiàn)圖 2-3）：
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2605669