銀杏花的化學(xué)成分及生物活性研究

發(fā)布時間：2020-03-29 02:07

【摘要】：銀杏(Ginkgo Biloba L.)為裸子植物門銀杏綱唯一的生存種,又名鴨腳樹、活化石,原產(chǎn)自中國,現(xiàn)世界各地均有種植,主要用于園藝美化及醫(yī)藥生產(chǎn)。銀杏具有抗氧化、抗炎、改善心腦血管及外周循環(huán)障礙、神經(jīng)保護(hù)、抗血小板聚集、抗腫瘤及抗輻射等作用。其主要化學(xué)成分包括黃酮類、萜內(nèi)酯類、酚酸類、聚異戊烯醇類等。目前國內(nèi)外關(guān)于銀杏的研究主要聚焦在銀杏葉及白果上,關(guān)于銀杏雄花的化學(xué)成分及生物活性尚無文獻(xiàn)報道。為了進(jìn)一步探究這一裸子植物花的化學(xué)成分及生物活性,本文首次對銀杏雄花提取物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究,并根據(jù)分離得到的化合物特性進(jìn)行相關(guān)的生物活性研究。本課題將干燥后的銀杏雄花70%乙醇提取物分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑進(jìn)行萃取,應(yīng)用AB-8大孔吸附樹脂柱層析、硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、反相C18開放柱色譜、制備型HPLC及重結(jié)晶等分離方法從銀杏花不同部位進(jìn)行分離純化,得到81個單體化合物。結(jié)合化合物的理化性質(zhì)及紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜及一維、二維核磁共振譜等波譜解析手段鑒定其中64個化合物的結(jié)構(gòu),包括2個新化合物及62個已知化合物。分別為醇苷類化合物9個,銀杏糖苷A(1),3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-1-辛烯-3-醇(3),己基-β-龍膽二糖苷(4),芐基-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),芐基-β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(6),dendranthemoside A(8),dihydrodendranthemoside A(9),alangionoside A(10),dihydroalangionoside A(11);酚苷類化合物1個,7-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-5-羥基-1(3H)-異苯并呋喃酮(7);苯丙素糖苷類9個,4-O-β-D-吡喃葡萄糖基反式肉桂酸(12),順式對香豆酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(13),對香豆醇葡萄糖苷(14),順式對香豆醇葡萄糖苷(15),松柏苷(16),順式松柏苷(17),甲基松柏苷(18),piperoside(19),stroside B(20);木脂素類4個,橄欖樹脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(21),dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside(22),(+)環(huán)橄欖脂素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(23),(-)異落葉松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(24);簡單苯丙素類4個,3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propane-1,2-diol(25),反式咖啡酸(26),七葉內(nèi)酯(27),對香豆酸(28);芳香酸類2個,4-羥基苯甲酸(29),原兒茶酸(30);雙黃酮類5個,穗花杉雙黃酮-7′′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2),穗花杉雙黃酮(31),金松雙黃酮(32),白果素(33),異銀杏黃素(34);黃酮(醇)類5個,異鼠李素(35),山柰酚(36),芹菜素(37),槲皮素(38),買麻藤乙素(39);黃酮苷類13個,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(40),山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(41),山柰酚-3-O-蕓香糖苷(42),槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(43),槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(44),異鼠李素-3-蕓香糖苷(45),山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(46),山柰酚-3-O-β-D-半乳糖基-4′-O-β-D-葡萄糖苷(47),異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(48),蘆丁(49),山柰酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(50),山柰酚-3-O-[6′′′-O-對�；�-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷](51),槲皮素-3-O-[6′′′-O-對�；�-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷](52);萜內(nèi)酯類2個,銀杏內(nèi)酯B(53),銀杏內(nèi)酯C(54);含氮類化合物4個,4,4′-dihydroxy-3,3′-imino-di-benzoic acid(55),尿嘧啶(56),尼克酰胺(57),argaminolic A(58);其他類6個,香草內(nèi)酯(59),胡蘿卜苷(60),β-谷甾醇(61),十六烷酸(62),白果酸(63),正二十三烷酸-1-甘油酯(64)。化合物1和2為新化合物,化合物3-15,17-24,55,58-59等24個化合物為首次從銀杏綱唯一生存種銀杏中分離得到。應(yīng)用Griess法、MTT法、ELISA、Real-time PCR等技術(shù)手段,以LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞為模型對用藥后的NO含量、細(xì)胞活力、TNF-α、IL-6、PGE_2及iNOS、COX-2的mRNA水平來活性評價銀杏花總提取物、各萃取部位及化合物1、3、5、12-14、16-18、21-24、31-34等的體外抗炎作用。實驗結(jié)果表明銀杏花總提物、氯仿和乙酸乙酯部位能夠有效抑制炎癥因子NO、TNF-α、IL-6及PGE_2等的產(chǎn)生,氯仿和乙酸乙酯部位為銀杏花的抗炎活性部位。單體化合物的篩選結(jié)果顯示:在藥物濃度為50μM時,化合物1,3,31-34均可以不同程度地抑制NO的產(chǎn)生,其中白果素(33)和異銀杏黃素(34)的NO抑制率高達(dá)80.19%和82.37%。其能夠通過有效地下調(diào)NO、TNF-α、IL-6、PGE_2及iNOS、COX-2的mRNA水平發(fā)揮抗炎作用,且呈劑量依賴關(guān)系。綜合運用MTT法、Giemsa染色法、PI法、AnnexinV-FITC/PI雙染法及Western Blot等分子生物學(xué)技術(shù)對經(jīng)雙黃酮類化合物處理后的腫瘤細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡比例及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究,數(shù)據(jù)顯示化合物33和34同樣具有抗腫瘤活性,二者對HeLa細(xì)胞更為敏感,能顯著抑制HeLa細(xì)胞的增殖,其IC_(50)值分別為14.79μM和8.38μM,且作用效果呈時間依賴性和劑量依賴性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,化合物33和34能夠顯著地改變細(xì)胞形態(tài),且呈劑量依賴性,確證了二者的腫瘤生長抑制作用。進(jìn)一步的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果表明,化合物33和34能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G2/M期,并能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡,其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)來實現(xiàn)。應(yīng)用~(60)Coγ射線輻照后的C57BL/6J小鼠模型,對銀杏葉提取物及銀杏花提取物的抗輻射作用進(jìn)行了比較研究。實驗結(jié)果表明:銀杏花提取物對受照小鼠的保護(hù)作用明顯高于銀杏葉提取物,給藥組受照小鼠的存活率分別為36.37%和9.09%,銀杏花提取物能夠延長輻照小鼠平均存活時間4.18天,并能夠明顯改善輻照后小鼠的外周血象水平,且給藥劑量為30mg/kg的銀杏花提取物具有更好的作用,其可能通過改善造血系統(tǒng)功能來發(fā)揮抗輻射作用。
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圖譜,化合物,附圖