【摘要】：天然抗腫瘤藥物是抗癌藥物的一個重要分支,在臨床抗癌治療中占有極其重要的地位。本研究選擇具有清熱消炎止咳作用,以及抗腫瘤潛力的中藥——翼齒六棱菊為研究對象,分離純化所含的小分子化合物,從中篩選具有促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長活性的物質(zhì),并探討其體外抗腫瘤作用的活性,為尋找高效、靶標獨特的抗腫瘤新藥提供研究基礎(chǔ)。取得了以下結(jié)果。1、應(yīng)用硅膠、凝膠、高效液相等多種色譜分離技術(shù),從翼齒六棱菊中分離到7個候選化合物,包括4個黃酮和3個倍半萜;經(jīng)NMR,MS等方法檢測,分別鑒定為5β-olide、Isocostic acid、3H-Naphth[1,8a-b]oxirene-7-acetic acid、Artemetin、3,6,7,4'-Tetra-O-methyl-5,3'-dihydroxyflavone、5-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,6,7-trimethoxy-4H-chromen-4-one、4',5-Dihydroxyflavone。2、采用MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)法評價翼齒六棱菊中分離到的上述7個化合物的體外抗腫瘤活性,濃度40μM時抑制率分別為90%、11.3%、4%、9.7%、16.1%、0%、2.9%,結(jié)果表明5β-olide抑癌活性最好。3、采用MTT法將5β-olide對SMMC 7721、SW480、MDA-MB-231、T47D和Hela這5株腫瘤細胞進行IC_(50)測定,其IC_(50)分別為3.36mM/L、4.04mM/L、11.8mM/L、10.57mM/L、14.31mM/L。4、通過檢測5β-olide處理后SMMC 7721、SW480的生長曲線,發(fā)現(xiàn)5β-olide濃度≥2mM,處理24h,開始出現(xiàn)細胞增殖的抑制活性。5、應(yīng)用熒光顯微鏡觀察SMMC 7721細胞核形態(tài)的變化;8mM的5β-olide處理SMMC 7721細胞24 h,細胞核發(fā)生了明顯的畸形變化,一些細胞核呈月牙型且皺縮邊集化,具有典型的凋亡形態(tài)。采用Hoechst/PI(Propidium Iodide)染色后發(fā)現(xiàn),隨著5β-olide濃度的加大和作用時間的延長,亮藍色的細胞增多,表明細胞凋亡增加。6、應(yīng)用DCFH-DA(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)方法檢測5β-olide對SMMC7721內(nèi)源活性氧的影響;通過ROS(reactive oxygen species)清除試驗檢測細胞凋亡是否與ROS有關(guān);結(jié)果表明,H_2O_2組及8mM 5β-olide處理組誘導(dǎo)明亮的綠色熒光產(chǎn)生,說明此時ROS大量生成;當(dāng)加入NAC(N-acetyl-L-cysteine)清除ROS之后,5β-olide對SMMC 7721的細胞毒性顯著降低,說明5β-olide是通過觸發(fā)ROS過度產(chǎn)生引起SMMC7721凋亡。7、通過檢測JC-1(5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl imidacarbocyanine iodide),觀察5β-olide對SMMC 7721線粒體膜電位的影響;使用Mito-tracker Red探針標記細胞線粒體后,在激光共聚焦下觀察5β-olide對細胞線粒體形態(tài)的影響;研究發(fā)現(xiàn):Control組細胞紅色熒光較強,FCCP組綠光較強,隨著5β-olide的濃度增加,綠色熒光逐漸增強,8mM時綠色熒光較強;用Mito-tracker Red染料染色,可發(fā)現(xiàn)5β-olide處理后的細胞線粒體呈顆粒狀,說明5β-olide能降低線粒體膜電位,使線粒體破碎。8、Western blot方法,觀察5β-olide處理SMMC 7721前后細胞線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的變化;發(fā)現(xiàn)5β-olide處理組Bax、Bid上調(diào),Bcl-2下調(diào),caspase 3和PARP上調(diào)。9、采用克隆形成試驗、細胞劃痕及transwell試驗,檢測5β-olide對SMMC 7721細胞生理性能的影響。5β-olide處理細胞24 h后,隨著5β-olide濃度升高,單克隆形成的集落越少;細胞劃痕愈合減少,愈合能力逐漸減弱,transwell細胞遷移到下室的數(shù)量也減少。結(jié)論:從翼齒六棱菊中分離到7個化合物,其中5β-olide抗腫瘤活性最好,并且可以抑制多種腫瘤細胞的增殖,對SMMC 7721抑制最強。5β-olide能引起7721細胞凋亡并使ROS過度產(chǎn)生,使線粒體膜電位降低,線粒體促凋亡蛋白Bax、Bid上調(diào),抑凋亡蛋白Bcl-2下調(diào),最終導(dǎo)致激活caspases啟動細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。因此本研究首次揭示了化合物5β-olide可以通過線粒體caspases途徑引起7721細胞凋亡且也是ROS依賴的凋亡。5β-olide能抑制細胞克隆的形成,細胞遷移。本研究為開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供了基礎(chǔ)研究。
【圖文】：

棱菊化學(xué)成分及生物活性研究六棱菊概述六棱菊屬植物共 3 種，其中作為藥用并被《中藥大辭典》收載的齒六棱菊。這兩種六棱菊屬植物均以干燥全草入藥，具有悠久的用（Laggerapterodonta(DC.)Benth.）是菊科、六棱菊屬草本。主要在云南民間稱臭靈丹，人們常常直接采集回來煮沸后過濾，喝濾而后有回甜，據(jù)記載具有止咳，清熱消炎的作用。經(jīng)過科研人員的驗證，證明翼齒六棱菊確實有療效，應(yīng)用廣泛。近年來開發(fā)出多且收到了較好的療效,主要有翼齒六棱菊注射液、翼齒六棱菊口服和翼齒六棱菊片劑、翼齒六棱菊浸膏等[2]。

貴州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文1.2.1 黃酮類化合物作為菊科植物,翼齒六棱菊中同樣含有大量的黃酮類化合物,昆明植物研究所郝小江課題組李順林等[3]，從翼齒六棱菊中分離鑒定了 penduletin（4’-5-二羥基-3，6，7-三甲氧基-黃酮）、5-hydroxy-3，4’，6，7-tetramethoxynavone、chrysosplenetin（4’-5-二羥基-3，3’，6，7-四甲氧基-黃酮）、artemitin（5-羥基-3，3’，4’，，6，7-五甲氧基-黃酮）。曹長姝等[4]人鑒定了幾種黃酮類化合物，主要有金腰乙素、槲皮素等，并從中測定了這類化合物對腫瘤細胞生長的抑制作用。部分代表結(jié)構(gòu)如下
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284.2;R285

【參考文獻】

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2 郝志云;楊新周;林惠昆;高楊秋;;云南不同地區(qū)臭靈丹提取物的抗氧化活性[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年05期

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本文編號：2603921