【摘要】：惡性胸膜間皮瘤(Malignant Pleural Mesothelioma,MPM)是一種源自胸膜間皮細胞的惡性侵襲性腫瘤,通常與石棉暴露有關(guān),從石棉暴露到間皮瘤形成的潛伏期大約是40年。石棉由于價格低廉,曾被廣泛用作防火、絕緣以及保溫材料,長期石棉暴露所導(dǎo)致的惡性間皮瘤在歐美等發(fā)達國家受到了高度的重視,2005年起歐盟就已全面禁止一切石棉的使用,但間皮瘤的發(fā)病率一直在增加,據(jù)估計,直到2020年左右,大多數(shù)工業(yè)化國家的MPM死亡率每年將以5-10%的速度增長。中國是溫石棉的生產(chǎn)和使用大國,石棉安全以及由其誘發(fā)的惡性胸膜間皮瘤問題亟待引起重視。惡性胸膜間皮瘤患者預(yù)后差,采用單一治療方法療效不理想,聯(lián)合手術(shù)、放療、化療可改善患者癥狀,延長生存時間,標準的一線化療方案是鉑類藥物聯(lián)合培美曲塞,但化療療程短,部分患者治療效果不佳。腫瘤細胞抵抗細胞毒性藥物引起的細胞凋亡是化療失敗的主要原因。因此,研究惡性胸膜間皮瘤中抗凋亡的相關(guān)通路和機制、尋找抑制抗凋亡通路的相關(guān)藥物是提高化療成功率的重要方向。從姜科植物根莖中提取的姜黃素,是一種天然植物源性多酚類化合物,能夠在多種惡性腫瘤的治療中發(fā)揮作用,研究表明其抗腫瘤機制主要是通過作用于多個靶點,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。細胞凋亡可以通過外源性途徑以及內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)發(fā)生,外源性凋亡途徑由細胞外死亡信號與細胞表面的凋亡受體作用介導(dǎo),主要激活細胞內(nèi)Caspase級聯(lián)反應(yīng);內(nèi)源性凋亡途徑是由細胞內(nèi)信號引發(fā)線粒體膜通透性改變并多種凋亡因子釋放,誘導(dǎo)細胞凋亡。凋亡的中心事件是Caspase的激活以及線粒體膜通透性改變,凋亡相關(guān)因子與多種信號通路在細胞內(nèi)形成異常復(fù)雜并且互相影響的網(wǎng)絡(luò),調(diào)控凋亡的發(fā)生。在過去的30年里,PI3K/Akt/mTOR作為受體酪氨酸激酶下游通路,在維持細胞蛋白質(zhì)合成、存活、生長、轉(zhuǎn)移、抵抗凋亡以及血管生成等多個方面發(fā)揮重要作用,已經(jīng)成為腫瘤學(xué)中重要通路之一。PI3K/Akt/mTOR通路內(nèi)的突變經(jīng)常發(fā)生的位置包括抑制基因PTEN和TSC1/2,以及癌基因PIK3CA、PIK3R1和Akt。PI3K/Akt/mTOR通路由于致癌基因突變以及腫瘤抑制因子失活導(dǎo)致通路功能異�；罨�,通過藥物阻斷或抑制該通路功能,是眾多臨床試驗的目標。既往有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路發(fā)揮抗腫瘤作用,另有研究發(fā)現(xiàn)惡性胸膜間皮瘤標本中PI3K/Akt/mTOR通路處于活躍狀態(tài),有關(guān)姜黃素治療MPM的研究報道較少,其作用機制、相關(guān)信號通路仍有待進一步完善。第一部分姜黃素對惡性胸膜間皮瘤RN5細胞增殖及凋亡的影響。目的:通過體內(nèi)外實驗探討姜黃素對惡性胸膜間皮瘤RN5細胞增殖以及凋亡的作用。實驗方法:1.將RN5細胞與不同濃度姜黃素、順鉑溶液孵育72小時后,用SRB方法分析細胞存活率,計算半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)。2.將RN5細胞接種在6孔板中,設(shè)置陰性對照DMSO組、不同濃度姜黃素組以及陽性對照順鉑組,藥物孵育細胞24小時后,流式細胞術(shù)檢測姜黃素對細胞周期及凋亡的影響。3.建立RN5細胞荷瘤小鼠模型,移植瘤最大徑達到6mm時,將小鼠隨機分成4組:溶劑對照組,低劑量姜黃素組,高劑量姜黃素組以及順鉑組,每5天給予腹腔內(nèi)注射藥物,定期測量腫瘤大小并計算腫瘤體積,同時記錄小鼠體重,待對照組腫瘤最大徑達到15mm時處死小鼠,收集腫瘤標本并記錄重量,評估姜黃素對小鼠體內(nèi)移植瘤生長的作用。4.荷瘤小鼠腫瘤標本福爾馬林固定石蠟包埋,組織切片,進行CD31和Ki67的免疫組織化學(xué)染色,并使用末端缺口原位標記(TUNEL)方法對腫瘤標本染色,顯微鏡下觀察染色結(jié)果,通過半定量分析,評估姜黃素對移植瘤細胞增殖、凋亡以及血管生成的作用。結(jié)果:1.梯度濃度姜黃素以及順鉑作用RN5細胞后,細胞的增殖受到不同程度的抑制,并且藥物的作用在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。通過繪制細胞增殖曲線,求得姜黃素在72小時的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50值為19.1±1.3μM,而順鉑的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50值為7.09±1.14μlM。2.細胞周期實驗結(jié)果表明,姜黃素以及順鉑作用RN5細胞24小時后,處于G2/M期的細胞比例增多,對比陰性對照DMSO存在統(tǒng)計學(xué)差異;凋亡實驗結(jié)果表明,姜黃素以及順鉑作用之后,RN5細胞早期及晚期凋亡比例增多,對比陰性對照組具有統(tǒng)計學(xué)差異。3.小鼠接種RN5細胞之后成瘤良好,姜黃素和順鉑組注射藥物5次之后,腫瘤體積小于對照組,其中順鉑組和高劑量姜黃素組腫瘤體積明顯低于對照組;處死動物后剝?nèi)∧[瘤并稱重,順鉑和姜黃素組腫瘤重量低于對照組,其中順鉑和高劑量姜黃素組腫瘤重量較對照組明顯降低;實驗結(jié)束時姜黃素組的小鼠體重較對照組差異不明顯,而順鉑組小鼠體重明顯低于對照組。4.腫瘤標本的Ki67免疫組化結(jié)果顯示,姜黃素組和順鉑組腫瘤Ki67表達陽性細胞比例減少,采取H評分法進行半定量評估,順鉑組和高劑量姜黃素組腫瘤標本Ki67染色H評分明顯低于對照組;TUNEL實驗顯示姜黃素組和順鉑組腫瘤陽性染色細胞比例增多,其中高劑量姜黃素組和順鉑組的TUNEL染色H評分明顯高于對照組;CD31結(jié)果顯示姜黃素組和順鉑組陽性染色面積減少,其中高劑量姜黃素組CD31陽性染色面積明顯低于對照組。結(jié)論:1.姜黃素能夠抑制惡性胸膜間皮瘤RN5細胞的增殖。2.姜黃素在可以體外誘導(dǎo)RN5細胞G2/M期細胞阻滯,并能誘導(dǎo)細胞凋亡。3.姜黃素在小鼠體內(nèi)可以抑制移植腫瘤的生長,且毒性作用不明顯。4.姜黃素在動物體內(nèi)能夠抑制腫瘤細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡,并發(fā)揮抗血管生成作用。第二部分姜黃素誘導(dǎo)RN5細胞凋亡的機制研究。目的:探討凋亡相關(guān)因子以及PI3K/Akt/mTOR信號通路在姜黃素誘導(dǎo)惡性胸膜間皮瘤RN5細胞凋亡過程中的作用。實驗方法:1.將RN5細胞接種于培養(yǎng)皿,設(shè)置陰性對照DMSO組、不同濃度姜黃素組以及陽性對照順鉑組,不同藥物孵育細胞24小時后,使用蛋白印跡法(Western blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白:Caspase-3/cleaved Caspase-3、Caspase-8/cleaved Caspase-8、Caspase-9/cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-xL、cleaved PARP 的細胞內(nèi)水平,評估內(nèi)源性以及外源性凋亡途徑在姜黃素誘導(dǎo)RN5細胞凋亡中的作用。2.通過Western blot檢測凋亡誘導(dǎo)因子AIF在細胞核內(nèi)的蛋白水平,并利用免疫熒光觀察AIF核轉(zhuǎn)位情況,探討AIF在姜黃素誘導(dǎo)RN5細胞凋亡中的作用。3.將RN5細胞接種于培養(yǎng)皿,設(shè)置陰性對照DMSO組以及不同濃度姜黃素組,藥物孵育細胞24小時后,通過Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白 PI3K、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR 以及 p70S6K/p-p70S6K 的細胞內(nèi)水平,評估該通路在姜黃素誘導(dǎo)RN5細胞凋亡中的作用。4.將RN5細胞接種于培養(yǎng)皿,分別使用PI3K、Akt、mTOR抑制劑預(yù)處理2小時后,再給予姜黃素孵育24小時,通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-xL、cleaved PARP 以及 PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR 的細胞內(nèi)水平,以期判斷姜黃素作用PI3K/Akt/mTOR通路的可能靶點。結(jié)果:1.不同濃度姜黃素孵育RN5細胞之后,各組細胞內(nèi)Caspase-3表達無明顯變化,順鉑組作用之后cleaved Caspase-3蛋白水平升高,姜黃素組及陰性對照DMSO 組均未能檢測到明顯 cleaved Caspase-3;各組 Caspase-8、Caspase-9 表達大致相近,姜黃素組以及順鉑組均未能檢測到明顯的cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-9 片段。姜黃素作用之后,RN5細胞內(nèi)cleaved-PARP的水平升高,促凋亡蛋白Bax水平升高,而凋亡抑制蛋白Bcl-xL水平降低,對比陰性對照DMSO組,姜黃素各組cleaved-PARP、Bax、Bcl-xL蛋白水平變化具有統(tǒng)計學(xué)差異。2.不同濃度姜黃素作用之后RN5細胞核內(nèi)AIF蛋白水平升高,對比陰性對照DMSO組,AIF水平升高具有統(tǒng)計學(xué)差異。免疫熒光法檢測AIF核轉(zhuǎn)位情況,結(jié)果提示AIF在細胞核內(nèi)的免疫熒光強度隨著姜黃素濃度的升高而增加;陰性對照DMSO組AIF 陽性免疫熒光主要聚集在細胞質(zhì)內(nèi)。3.不同濃度姜黃素孵育RN5細胞之后,姜黃素組細胞內(nèi)PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K蛋白水平下調(diào),對比陰性對照DMSO組,相關(guān)蛋白水平降低具有統(tǒng)計學(xué)差異;而Akt、mTOR、p70S6K表達水平無明顯變化。4.分別使用PI3K抑制劑LY294002,Akt抑制劑MK 2206,以及mTOR的抑制劑Rapamycin預(yù)處理RN5細胞之后再次使用姜黃素孵育,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LY294002和Rapamycin作用于RN5細胞后,沒有對PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達產(chǎn)生顯著影響;Akt抑制劑MK 2206作用于RN5細胞后,p-Akt表達水平顯著升高,并干擾了姜黃素對Bax、cleaved-PARP、Bcl-xL的作用。結(jié)論:1.姜黃素在RN5細胞內(nèi)能夠通過不依賴于Caspase,由AIF核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)的線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細胞凋亡。2.姜黃素能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。3.姜黃素通路作用的靶點可能是Akt,通過抑制Akt磷酸化而抑制腫瘤增殖,誘導(dǎo)凋亡。
【圖文】：

梯度濃度溶液來處理ＲＮ５細胞，在使用遞增濃度的姜黃素及順鉑處理７２小時后逡逑測定細胞存活情況。逡逑結(jié)果表明（圖１），當(dāng)順鉑濃度２２．５ＭＭ時，細胞存活率對比０．２５＾Ｍ濃度出逡逑現(xiàn)明顯下降，并且ＲＮ５細胞存活率隨著順鉑濃度的增加而降低；當(dāng)姜黃素濃度逡逑２１５＾Ｍ時，細胞存活率對比丨濃度出現(xiàn)明顯下降，ＲＮ５細胞存活率隨著姜黃逡逑素濃度的增加而降低。結(jié)果提示，姜黃素以及順鉑溶液達到一定濃度后，可抑制逡逑ＲＮ５細胞的增殖，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。逡逑通過繪制細胞增殖曲線，求得姜黃素在７２小時的半數(shù)效應(yīng)濃度ＥＣ５０值為逡逑１９．１０±１．３（ＨｉＭ，而順鈾的半數(shù)效應(yīng)濃度ＥＣ５０值為７．０９±１．１４ｈＭ，５＾Ｍ順鉑在處逡逑理７２小時后殺死約５０％的ＲＮ５細胞，而２０ＰＭ姜黃素引起相似的作用，順鉑對逡逑ＲＮ５細胞的細胞毒性比姜黃素更強。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑１２０邋ｒ邐—］邐１２０邋邐逡逑＾邋１００邋？邐＊邐卜、ｒ邐一邋１００邐■￣■￣￣—＾逡逑＾邋８０邐匕邋８０邐Ａ．逡逑１邋６0邐＼邐１邋６0邐ＮＴ逡逑ｉ邋２０邐Ｖ邋？邋２０逡逑Ｕ邋ｎ邐Ｕ邋．逡逑０邋Ｃｕｒｃｕｍｉｎ邐＊＊＊＊＊＊邐０邋Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ逡逑０．０邐０．５邐１．０邐１．５邐－１．０邋－０．５邐０．０邐０．５邐１．０邐１．５邐２．０逡逑Ｌｏｇ邋ｄｏｓｅ邋（ＪＩＭ）邐Ｌｏｇ邋ｄｏｓｅ邋（＾ｉＭ）逡逑圖１不同濃度姜黃素以及順鉑溶液對ＲＮ５細胞存活率影響。逡逑Ａ：用濃度為丨

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑細胞２４小時后，姜黃素以及順柏組處于Ｇ２／Ｍ期的細胞比例均高于對照ＤＭＳＯ逡逑組，其中姜黃素１５＾Ｍ組Ｇ２／Ｍ期細胞比例，相比對照ＤＭＳＯ組具有統(tǒng)計學(xué)差逡逑異（ｐ＜０．０５），而姜黃素濃度為２０和２５ｐＭ以及順鉑３０｜ａＭ作用之后，更多的逡逑細胞處于Ｇ２／Ｍ期，，具有統(tǒng)計學(xué)差異（；７＜０．０１），不同濃度姜黃素溶液作用后，逡逑Ｇ２／Ｍ期阻滯的ＲＮ５細胞比例隨著姜黃素濃度的升高而同樣升高，提示姜黃素能逡逑夠誘導(dǎo)ＲＮ５細胞Ｇ２／Ｍ期阻滯。逡逑■邋ｔｅｄｉ邐■0＊？！邐■0？？？逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

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1 郝迎濤;姜黃素對惡性胸膜間皮瘤RN5細胞增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)的機制研究[D];山東大學(xué);2019年

本文編號：2603210