發(fā)布時(shí)間：2020-03-27 04:05

【摘要】：研究背景:肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism,PTE)是臨床常見病,嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。早期診斷、早期治療、改善預(yù)后,是臨床工作者面臨的重大問題。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶系統(tǒng)作用下產(chǎn)生的可溶性降解產(chǎn)物,為一特異性的纖溶過程標(biāo)記物,對(duì)PTE的診斷有高度的敏感性和中等度特異性。乳酸脫氫酶(Lactate dbhydrogenase,LDH)存在于機(jī)體許多組織中,其同工酶LDH3主要存在于肺組織中,是肺損傷的指標(biāo)之一,當(dāng)PTE發(fā)生后,血液內(nèi)LDH3濃度升高,活力上升,因此LDH3對(duì)PTE的診斷有一定的特異性。組織纖溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator,t-PA)主要功能是將纖溶酶原激活成為纖溶酶,急性PTE后血管內(nèi)皮受損,內(nèi)源性纖溶系統(tǒng)激活,血漿t-PA濃度會(huì)明顯升高,本實(shí)驗(yàn)通過建立兔急性PTE的模型,動(dòng)態(tài)聯(lián)合檢測(cè)了 PTE后D-二聚體、LDH3及t-PA的含量,探討能否提高PTE診斷的敏感性和特異性。目前對(duì)PTE的治療方法應(yīng)用最多的是溶栓治療,此法可以迅速的溶解部分或者全部血栓,有效的恢復(fù)組織的再灌注能力,但是其諸多并發(fā)癥也表現(xiàn)的越來越突出,其中溶栓后出現(xiàn)的缺血-再灌注損傷(Ischemia-reperfusioninjury,IRI)尤為明顯,其主要是指遭受缺血一定時(shí)間的組織恢復(fù)血供后,細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重的病理現(xiàn)象,其發(fā)生的機(jī)制主要包括機(jī)體氧自由基以及脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)、中性粒細(xì)胞的聚集和活化等。中醫(yī)中藥對(duì)PTE的治療越來越受到關(guān)注,千百年來黃芪的功效被不斷拓展發(fā)掘而被廣泛應(yīng)用于治療眾多疾病。黃芪屬豆科,已有兩千多年的用藥歷史,黃芪有200多種成分,其中皂甙和黃酮類化合物以及多糖被認(rèn)為是主要的藥理活性成分�，F(xiàn)代研究表明黃芪具有一系列藥理作用,涉及心血管、腎臟、肝臟及呼吸等系統(tǒng)疾病,尤其在心血管系統(tǒng)保護(hù)方面得到了廣泛且深入的研究,其作用機(jī)制包括抗氧化應(yīng)激、抑制凋亡水平、抗纖維化、調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞離子通道活性、改善心肌代謝、拮抗炎癥反應(yīng)、抗病毒等。黃芪是補(bǔ)氣藥的代表,黃芪的“益氣”作用與促血管新生有著密切關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有促進(jìn)心肌梗死后血管新生、抗心肌纖維化、下調(diào)炎癥因子及上調(diào)抗炎細(xì)胞因子的水平、抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、改善心肌能量代謝的作用,同時(shí)黃芪還具有抑制鈣離子通道、抑制血小板聚集、參與免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)、激活和調(diào)控等作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道黃芪可促進(jìn)腦缺血再灌注后血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)的表達(dá)而對(duì)腦組織起保護(hù)作用。VEGF和bFGF都是與肝素結(jié)合的血小板源生長因子,能誘導(dǎo)體內(nèi)和體外血管生長,它們共同維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖。低氧血癥可刺激VEGF和bFGF表達(dá)增加,二者具有促進(jìn)血管擴(kuò)張、血管通透性增加、上調(diào)VEGF受體、釋放蛋白溶解酶、表達(dá)抗凋亡基因等作用。已有研究證實(shí)VEGF和bFGF可促進(jìn)PTE后機(jī)體血管內(nèi)皮損傷的代償性修復(fù)。那么黃芪是否可以通過促進(jìn)PTE后體內(nèi)VEGF、bFGF的表達(dá)而對(duì)PTE的治療起積極作用?能否對(duì)PTE溶栓引起的缺血再灌注損傷有預(yù)防和保護(hù)作用?本研究應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法分三個(gè)部分逐一對(duì)上述問題進(jìn)行探討。第一部分肺血栓栓塞癥模型制備及診斷研究目的:觀察PTE后早期血LDH3、D-二聚體和t-PA的動(dòng)態(tài)變化,探討三者對(duì)診斷PTE的特異性和敏感性,并確認(rèn)PTE模型制備成功。研究方法:1動(dòng)物分組:隨機(jī)將16只雄兔分為兩組,對(duì)照組(S組)、栓塞組(T組)各8只。2 T組采用自體血加凝血酶加纖維蛋白原的方法制備兔PTE模型。3 CT肺血管造影確認(rèn)造模是否成功。4對(duì)比栓塞前后血流動(dòng)力學(xué)變化(PAMP、PASP、PADP、PAWP)。5血液標(biāo)本采集:分別于栓塞前、栓塞后30分鐘、2小時(shí)、4小時(shí)、24小時(shí)、3天、5天采靜脈血、保存?zhèn)溆谩? ELISA法測(cè)定血漿D-二聚體。7 ELISA法測(cè)定血漿t-PA。8全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清LDH3。9栓塞5天后將兔處死,剖胸取肺組織,HE染色制病理切片,觀察結(jié)果。結(jié)果:1 CT肺血管造影確認(rèn)造模成功2T組PAWP基本不變,PAMP、PASP、PADP在栓塞后即刻明顯升高,栓塞后1小時(shí)上述指標(biāo)仍維持在較高水平,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。3 T組D-二聚體含量在栓塞后30分鐘開始上升,栓塞后2小時(shí)達(dá)到峰值,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。4T組LDH3含量于栓塞后2小時(shí)開始升高,栓塞后24小時(shí)達(dá)峰值,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。5 T組t-PA于栓塞后30分鐘開始升高,至栓塞后4小時(shí)達(dá)峰值,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。6組織病理學(xué)觀察:T組切片可見PTE表現(xiàn),進(jìn)一步證實(shí)造模成功。結(jié)論:1、自體血栓中加入人纖維蛋白原制備兔急性PTE的模型,可反映PTE發(fā)生后的病理生理過程,該造模方法成功,為后續(xù)PTE的研究奠定基礎(chǔ)。2、動(dòng)態(tài)聯(lián)合檢測(cè)D-二聚體、LDH3及t-PA能有效反應(yīng)PTE病情的嚴(yán)重程度,提高了診斷PTE的特異性和敏感性。第二部分 黃芪注射液對(duì)肺血栓栓塞癥治療的實(shí)驗(yàn)研究研究目的:通過觀察不同劑量黃芪注射液對(duì)PTE后機(jī)體VEGF、bFGF表達(dá)的影響,探討其對(duì)PTE的治療作用。研究方法:1動(dòng)物分組及處理:40只雄兔隨機(jī)分為對(duì)照組(S組)10只,栓塞組(T組)30只,栓塞組進(jìn)行PTE模型制備。2 CT肺血管造影確認(rèn)造模是否成功。3再將栓塞組分為黃芪低劑量治療組(Tl組)、黃芪中劑量治療組(Tm組)、黃芪高劑量治療組(Th組)各10只,各組分別在造模后1天、2天、3天、4天注射不同劑量的黃芪注射液(2g/kg、4g/kg、6g/kg),每天各一次。S組注射等量生理鹽水。4血液標(biāo)本采集:分別于栓塞前、栓塞后12小時(shí)、及治療后第1、4天采集靜脈血2ml。5 ELISA法測(cè)定血清VEGF、bFGF含量。6于治療后第4天采血完畢后將兔處死,剖胸取肺組織。7采用Western-blot方法檢測(cè)肺組織VEGF及bFGF蛋白表達(dá)。8肺組織HE染色,制片、觀察結(jié)果。結(jié)果:1 CT肺血管造影確認(rèn)造模成功。2各栓塞組經(jīng)黃芪注射液治療后兔血清VEGF、bFGF含量均上升,以黃芪高劑量組最為明顯。與Tl組比較,Tm組升高,差異具有顯著性(P0.05);與Tm組比較,Th組升高,差異具有顯著性(P0.05)。3各栓塞組經(jīng)黃芪注射液治療后肺組織VEGF及bFGF蛋白表達(dá)均上調(diào),其上調(diào)趨勢(shì)與黃芪治療劑量呈正相關(guān)。與Tl組比較,Tm組上調(diào),差異具有顯著性(P0.05);與Tm組比較,Th組上調(diào),差異具有顯著性(P0.05)。4組織病理學(xué)觀察:與S組比較,各栓塞組肺組織有不同程度PTE損傷表現(xiàn);與Tl組比較,Tm組損傷程度減輕;與Tm組比較,Th組損傷程度減輕,可確認(rèn)Th組治療效果最明顯。結(jié)論:1PTE經(jīng)黃芪注射液治療后,機(jī)體內(nèi)血清及肺組織VEGF、bFGF表達(dá)上調(diào),其上調(diào)趨勢(shì)與黃芪注射液治療劑量呈正相關(guān)。2黃芪注射液可通過促進(jìn)VEGF、bFGF的表達(dá)而提高PTE后機(jī)體的代償修復(fù)機(jī)制,對(duì)其治療起積極作用。第三部分黃芪注射液對(duì)肺血栓栓塞癥溶栓后再灌注損傷的影響研究目的:通過檢測(cè)PTE溶栓后體內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondiadehyde,MDA)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MOP)及肺濕干重量比(W/D)的變化,探討急性PTE溶栓后再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制,并應(yīng)用黃芪注射液作為干預(yù)劑研究其在肺組織缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。研究方法:1動(dòng)物分組及處理:隨機(jī)將40只雄兔分為四組:對(duì)照組(S組)、單純栓塞組(T組)、尿激酶溶栓組(U組)、黃芪干預(yù)組(H組)各10只。S組不注入血栓,只在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)注入等量生理鹽水;T組行急性PTE模型制備,不進(jìn)行溶栓治療;U組注入自體血栓2小時(shí)后進(jìn)行尿激酶溶栓治療(肺缺血再灌注模型制備);H組注入血栓2小時(shí)后進(jìn)行尿激酶溶栓治療,且在溶栓治療前即刻給予黃芪注射液進(jìn)行干預(yù)(6g/kg)。2CT肺血管造影確認(rèn)造模是否成功:(1)急性PTE模型;(2)肺缺血-再灌注損傷模型。3標(biāo)本采集:各組分別在栓塞前、栓塞后2小時(shí)、溶栓后1小時(shí)、3小時(shí)經(jīng)留置針采集靜脈血2ml,4℃保存待測(cè);采血完畢后將兔處死,剖胸取肺組織,固定,-70℃保存?zhèn)溆谩?分別于上述各時(shí)點(diǎn)測(cè)定血清SOD、MDA、VEGF含量。5提取肺組織測(cè)定勻漿MPO含量、肺濕干重量比(W/D)。6 Western-blot方法檢測(cè)肺組織VEGF蛋白表達(dá)。7肺組織HE染色,制片、觀察結(jié)果。結(jié)果:1 CT肺血管造影證實(shí)造模成功(急性PTE模型及肺缺血-再灌注損傷模型)。2溶栓后同時(shí)段血清SOD含量比較:與T組比較,U組降低,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05)。3溶栓后同時(shí)段血清MDA含量比較:與T組比較,U組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組降低,差異具有顯著性(P0.05)。4溶栓后肺組織MPO含量比較:與T組比較,U組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組降低,差異具有顯著性(P0.05)。5溶栓后肺組織W/D值:與T組比較,U組稍升高,差異無顯著性(P0.05);與U組比較,H組降低,差異具有顯著性(P0.05)。6溶栓后同時(shí)段血清VEGF含量比較:與T組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05)。7溶栓后肺組織VEGF蛋白表達(dá):與T組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05)。8組織病理學(xué)觀察:與S組比較,T、U、H組有不同程度肺組織損傷表現(xiàn);與T組比較,U組肺組織損傷程度加重;與U組比較,H組肺組織損傷明顯減輕。結(jié)論:1急性PTE溶栓治療后可發(fā)生缺血一再灌注損傷。2黃芪可通過促進(jìn)機(jī)體VEGF的表達(dá)而減弱氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),提高機(jī)體的抗氧化能力,可減輕肺缺血再灌注后微血管的損傷程度,抑制溶栓后肺組織中性粒細(xì)胞的聚集,對(duì)肺缺血-再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。
【圖文】：

圖１：兩組ＣＴ肺血管造影結(jié)果逡逑

圖２：肺組織病理結(jié)果ＨＥＸ４０逡逑
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2602436