發(fā)布時間：2020-03-27 04:05

【摘要】：研究背景:肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism,PTE)是臨床常見病,嚴重威脅著患者的生命健康。早期診斷、早期治療、改善預后,是臨床工作者面臨的重大問題。D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶系統(tǒng)作用下產(chǎn)生的可溶性降解產(chǎn)物,為一特異性的纖溶過程標記物,對PTE的診斷有高度的敏感性和中等度特異性。乳酸脫氫酶(Lactate dbhydrogenase,LDH)存在于機體許多組織中,其同工酶LDH3主要存在于肺組織中,是肺損傷的指標之一,當PTE發(fā)生后,血液內(nèi)LDH3濃度升高,活力上升,因此LDH3對PTE的診斷有一定的特異性。組織纖溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator,t-PA)主要功能是將纖溶酶原激活成為纖溶酶,急性PTE后血管內(nèi)皮受損,內(nèi)源性纖溶系統(tǒng)激活,血漿t-PA濃度會明顯升高,本實驗通過建立兔急性PTE的模型,動態(tài)聯(lián)合檢測了 PTE后D-二聚體、LDH3及t-PA的含量,探討能否提高PTE診斷的敏感性和特異性。目前對PTE的治療方法應用最多的是溶栓治療,此法可以迅速的溶解部分或者全部血栓,有效的恢復組織的再灌注能力,但是其諸多并發(fā)癥也表現(xiàn)的越來越突出,其中溶栓后出現(xiàn)的缺血-再灌注損傷(Ischemia-reperfusioninjury,IRI)尤為明顯,其主要是指遭受缺血一定時間的組織恢復血供后,細胞功能代謝障礙及結構破壞反而加重的病理現(xiàn)象,其發(fā)生的機制主要包括機體氧自由基以及脂質(zhì)的過氧化反應、中性粒細胞的聚集和活化等。中醫(yī)中藥對PTE的治療越來越受到關注,千百年來黃芪的功效被不斷拓展發(fā)掘而被廣泛應用于治療眾多疾病。黃芪屬豆科,已有兩千多年的用藥歷史,黃芪有200多種成分,其中皂甙和黃酮類化合物以及多糖被認為是主要的藥理活性成分�，F(xiàn)代研究表明黃芪具有一系列藥理作用,涉及心血管、腎臟、肝臟及呼吸等系統(tǒng)疾病,尤其在心血管系統(tǒng)保護方面得到了廣泛且深入的研究,其作用機制包括抗氧化應激、抑制凋亡水平、抗纖維化、調(diào)節(jié)心肌細胞離子通道活性、改善心肌代謝、拮抗炎癥反應、抗病毒等。黃芪是補氣藥的代表,黃芪的“益氣”作用與促血管新生有著密切關系,研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有促進心肌梗死后血管新生、抗心肌纖維化、下調(diào)炎癥因子及上調(diào)抗炎細胞因子的水平、抗心肌細胞氧化應激損傷、改善心肌能量代謝的作用,同時黃芪還具有抑制鈣離子通道、抑制血小板聚集、參與免疫系統(tǒng)的誘導、激活和調(diào)控等作用。已有文獻報道黃芪可促進腦缺血再灌注后血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)的表達而對腦組織起保護作用。VEGF和bFGF都是與肝素結合的血小板源生長因子,能誘導體內(nèi)和體外血管生長,它們共同維持血管內(nèi)皮細胞的存活和增殖。低氧血癥可刺激VEGF和bFGF表達增加,二者具有促進血管擴張、血管通透性增加、上調(diào)VEGF受體、釋放蛋白溶解酶、表達抗凋亡基因等作用。已有研究證實VEGF和bFGF可促進PTE后機體血管內(nèi)皮損傷的代償性修復。那么黃芪是否可以通過促進PTE后體內(nèi)VEGF、bFGF的表達而對PTE的治療起積極作用?能否對PTE溶栓引起的缺血再灌注損傷有預防和保護作用?本研究應用多種實驗方法分三個部分逐一對上述問題進行探討。第一部分肺血栓栓塞癥模型制備及診斷研究目的:觀察PTE后早期血LDH3、D-二聚體和t-PA的動態(tài)變化,探討三者對診斷PTE的特異性和敏感性,并確認PTE模型制備成功。研究方法:1動物分組:隨機將16只雄兔分為兩組,對照組(S組)、栓塞組(T組)各8只。2 T組采用自體血加凝血酶加纖維蛋白原的方法制備兔PTE模型。3 CT肺血管造影確認造模是否成功。4對比栓塞前后血流動力學變化(PAMP、PASP、PADP、PAWP)。5血液標本采集:分別于栓塞前、栓塞后30分鐘、2小時、4小時、24小時、3天、5天采靜脈血、保存?zhèn)溆谩? ELISA法測定血漿D-二聚體。7 ELISA法測定血漿t-PA。8全自動生化分析儀測定血清LDH3。9栓塞5天后將兔處死,剖胸取肺組織,HE染色制病理切片,觀察結果。結果:1 CT肺血管造影確認造模成功2T組PAWP基本不變,PAMP、PASP、PADP在栓塞后即刻明顯升高,栓塞后1小時上述指標仍維持在較高水平,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。3 T組D-二聚體含量在栓塞后30分鐘開始上升,栓塞后2小時達到峰值,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。4T組LDH3含量于栓塞后2小時開始升高,栓塞后24小時達峰值,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。5 T組t-PA于栓塞后30分鐘開始升高,至栓塞后4小時達峰值,與栓塞前比較,差異具有顯著性(P0.05)。6組織病理學觀察:T組切片可見PTE表現(xiàn),進一步證實造模成功。結論:1、自體血栓中加入人纖維蛋白原制備兔急性PTE的模型,可反映PTE發(fā)生后的病理生理過程,該造模方法成功,為后續(xù)PTE的研究奠定基礎。2、動態(tài)聯(lián)合檢測D-二聚體、LDH3及t-PA能有效反應PTE病情的嚴重程度,提高了診斷PTE的特異性和敏感性。第二部分 黃芪注射液對肺血栓栓塞癥治療的實驗研究研究目的:通過觀察不同劑量黃芪注射液對PTE后機體VEGF、bFGF表達的影響,探討其對PTE的治療作用。研究方法:1動物分組及處理:40只雄兔隨機分為對照組(S組)10只,栓塞組(T組)30只,栓塞組進行PTE模型制備。2 CT肺血管造影確認造模是否成功。3再將栓塞組分為黃芪低劑量治療組(Tl組)、黃芪中劑量治療組(Tm組)、黃芪高劑量治療組(Th組)各10只,各組分別在造模后1天、2天、3天、4天注射不同劑量的黃芪注射液(2g/kg、4g/kg、6g/kg),每天各一次。S組注射等量生理鹽水。4血液標本采集:分別于栓塞前、栓塞后12小時、及治療后第1、4天采集靜脈血2ml。5 ELISA法測定血清VEGF、bFGF含量。6于治療后第4天采血完畢后將兔處死,剖胸取肺組織。7采用Western-blot方法檢測肺組織VEGF及bFGF蛋白表達。8肺組織HE染色,制片、觀察結果。結果:1 CT肺血管造影確認造模成功。2各栓塞組經(jīng)黃芪注射液治療后兔血清VEGF、bFGF含量均上升,以黃芪高劑量組最為明顯。與Tl組比較,Tm組升高,差異具有顯著性(P0.05);與Tm組比較,Th組升高,差異具有顯著性(P0.05)。3各栓塞組經(jīng)黃芪注射液治療后肺組織VEGF及bFGF蛋白表達均上調(diào),其上調(diào)趨勢與黃芪治療劑量呈正相關。與Tl組比較,Tm組上調(diào),差異具有顯著性(P0.05);與Tm組比較,Th組上調(diào),差異具有顯著性(P0.05)。4組織病理學觀察:與S組比較,各栓塞組肺組織有不同程度PTE損傷表現(xiàn);與Tl組比較,Tm組損傷程度減輕;與Tm組比較,Th組損傷程度減輕,可確認Th組治療效果最明顯。結論:1PTE經(jīng)黃芪注射液治療后,機體內(nèi)血清及肺組織VEGF、bFGF表達上調(diào),其上調(diào)趨勢與黃芪注射液治療劑量呈正相關。2黃芪注射液可通過促進VEGF、bFGF的表達而提高PTE后機體的代償修復機制,對其治療起積極作用。第三部分黃芪注射液對肺血栓栓塞癥溶栓后再灌注損傷的影響研究目的:通過檢測PTE溶栓后體內(nèi)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondiadehyde,MDA)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MOP)及肺濕干重量比(W/D)的變化,探討急性PTE溶栓后再灌注損傷的發(fā)生機制,并應用黃芪注射液作為干預劑研究其在肺組織缺血再灌注損傷中的保護作用。研究方法:1動物分組及處理:隨機將40只雄兔分為四組:對照組(S組)、單純栓塞組(T組)、尿激酶溶栓組(U組)、黃芪干預組(H組)各10只。S組不注入血栓,只在相應時間點注入等量生理鹽水;T組行急性PTE模型制備,不進行溶栓治療;U組注入自體血栓2小時后進行尿激酶溶栓治療(肺缺血再灌注模型制備);H組注入血栓2小時后進行尿激酶溶栓治療,且在溶栓治療前即刻給予黃芪注射液進行干預(6g/kg)。2CT肺血管造影確認造模是否成功:(1)急性PTE模型;(2)肺缺血-再灌注損傷模型。3標本采集:各組分別在栓塞前、栓塞后2小時、溶栓后1小時、3小時經(jīng)留置針采集靜脈血2ml,4℃保存待測;采血完畢后將兔處死,剖胸取肺組織,固定,-70℃保存?zhèn)溆谩?分別于上述各時點測定血清SOD、MDA、VEGF含量。5提取肺組織測定勻漿MPO含量、肺濕干重量比(W/D)。6 Western-blot方法檢測肺組織VEGF蛋白表達。7肺組織HE染色,制片、觀察結果。結果:1 CT肺血管造影證實造模成功(急性PTE模型及肺缺血-再灌注損傷模型)。2溶栓后同時段血清SOD含量比較:與T組比較,U組降低,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05)。3溶栓后同時段血清MDA含量比較:與T組比較,U組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組降低,差異具有顯著性(P0.05)。4溶栓后肺組織MPO含量比較:與T組比較,U組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組降低,差異具有顯著性(P0.05)。5溶栓后肺組織W/D值:與T組比較,U組稍升高,差異無顯著性(P0.05);與U組比較,H組降低,差異具有顯著性(P0.05)。6溶栓后同時段血清VEGF含量比較:與T組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05)。7溶栓后肺組織VEGF蛋白表達:與T組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05);與U組比較,H組升高,差異具有顯著性(P0.05)。8組織病理學觀察:與S組比較,T、U、H組有不同程度肺組織損傷表現(xiàn);與T組比較,U組肺組織損傷程度加重;與U組比較,H組肺組織損傷明顯減輕。結論:1急性PTE溶栓治療后可發(fā)生缺血一再灌注損傷。2黃芪可通過促進機體VEGF的表達而減弱氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化反應,提高機體的抗氧化能力,可減輕肺缺血再灌注后微血管的損傷程度,抑制溶栓后肺組織中性粒細胞的聚集,對肺缺血-再灌注損傷具有一定的保護作用。
【圖文】：

圖１：兩組ＣＴ肺血管造影結果逡逑

圖２：肺組織病理結果ＨＥＸ４０逡逑
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2602436