【摘要】：目前,心腦血管疾病占我國(guó)居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上,是我國(guó)居民死亡的第一大原因,而且患病率和死亡率仍處在上升階段,因此,亟待開(kāi)發(fā)或?qū)σ延兴幬镞M(jìn)行優(yōu)化得到療效確切的預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物。中藥葛根及其復(fù)方是臨床常用藥,在心腦血管疾病的預(yù)防和治療方面應(yīng)用廣泛。異黃酮類(lèi)成分是葛根中的活性成分,本研究以此為出發(fā)點(diǎn),建立葛根中多種異黃酮成分的指紋圖譜或“化學(xué)條形碼”及質(zhì)量控制方法,并以此為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)葛根提取物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,以保證在后續(xù)中藥配方中葛根的質(zhì)量和療效。丹參和三七也是心血管疾病常用的、活性成分作用比較明確的藥物,這三種藥材在治療心腦血管的復(fù)方藥物中配伍出現(xiàn)的頻率高。因此,針對(duì)這三種藥材配伍,建立單味藥材的指紋圖譜以期應(yīng)用于其組方的中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制,建立多組分定性定量檢測(cè)的快速液相(RRLC)分析方法。新開(kāi)發(fā)的分析圖譜可直接鑒定每一單味藥材的成分分布,打破“丸散膏丹,神仙難辨”的局面,為中藥復(fù)方的質(zhì)量控制提供新的思路和方法。同時(shí)通過(guò)研究成分明確的葛根復(fù)方抗低密度脂蛋白基因敲除(LDL-R~(-/-))倉(cāng)鼠動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的效果,從而篩選出作用突出的藥物配比。一.葛根提取物的制備工藝研究采用響應(yīng)面法對(duì)葛根的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,主要考察因素為乙醇濃度(0-100%)、液料比(8-12倍)和提取時(shí)間(1-3h)等因素的影響,優(yōu)化得到的最佳條件為乙醇濃度65%,液料比10.97倍,提取時(shí)間為3h,其中乙醇濃度和溶劑使用量對(duì)葛根主要異黃酮提取率有顯著影響(p0.01),提取溫度考察確定溫度為80oC時(shí)提取效率最高。結(jié)合后續(xù)生產(chǎn)實(shí)際情況確定提取條件為乙醇濃度65%,液料比11倍,提取2次,第一次3h,第二次2h,提取溫度80oC。大孔吸附樹(shù)脂純化葛根主要異黃酮的工藝考察,包含樹(shù)脂的選擇、上樣量、上樣速率、稀釋倍數(shù)、徑高比、沖洗用水量和洗脫用乙醇濃度及用量等因素。純化工藝考察確定選用樹(shù)脂AB-8;上樣量為生藥材:樹(shù)脂量=1:2;徑高比為1:6;上樣液濃度為0.5g生藥材/ml溶液;上樣速度為3BV/h;上樣完成后先用8BV純化水洗脫,然后用70%乙醇洗脫7BV,收集洗脫液,干燥即得。二.RRLC用于葛根及復(fù)方的質(zhì)量分析研究1.葛根RRLC一測(cè)多評(píng)法(QAMS)和特征圖譜的建立選取葛根主要有效成分異黃酮成分3’-羥基葛根素、葛根素、葛根素6’’-O-木糖苷、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素和大豆苷等作為檢測(cè)指標(biāo)建立葛根及其提取物的RRLC分析方法,整個(gè)分析過(guò)程14min完成。通過(guò)配制6種成分不同濃度對(duì)照品溶液分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,將葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與另外5種成分斜率的比值確定為各成分的相對(duì)校正因子,分別為1.253,1.422,1.297,1.332和1.030。后續(xù)檢測(cè)僅需葛根素對(duì)照結(jié)合相對(duì)校正因子就可實(shí)現(xiàn)“一測(cè)多評(píng)”。比較“一測(cè)多評(píng)法”和常規(guī)方法測(cè)定樣品其他5種成分的含量,偏差均小于1.5%。運(yùn)用該方法測(cè)定了不同來(lái)源的38批葛根藥材、6批粉葛藥材和8批市售葛根提取物。其中1批葛根提取物中未檢測(cè)出上述6種異黃酮類(lèi)成分,對(duì)其余樣品中6種成分標(biāo)準(zhǔn)化后的峰面積進(jìn)行主成分(PCA)分析和統(tǒng)計(jì)分析。PCA分析可以直觀地鑒別葛根和粉葛,同時(shí)通過(guò)樣品的主成分1(PC1)的投影位置可以對(duì)葛根品質(zhì)做出評(píng)價(jià);統(tǒng)計(jì)分析顯示葛根中的3’-羥基葛根素/葛根素(峰面積比)、3’-甲氧基葛根素/葛根素和芹糖基葛根素/葛根素在葛根中均大于0.1,而在粉葛中均小于0.1;葛根藥材中3’-甲氧基葛根素/大豆苷和芹糖基葛根素/大豆苷幾乎都在0.6及以上,而粉葛中剛好相反。各種成分的分布在葛根和市售的葛根提取物中較一致。同時(shí)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版對(duì)葛根及提取物和葛根對(duì)照藥材共46批樣品進(jìn)行分析,共有峰有9個(gè),相似度計(jì)算結(jié)果顯示46批樣品的RRLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果均在0.96以上,表明各批次藥材或提取物與對(duì)照指紋圖譜具有很好的一致性。。2.葛根、丹參和三七復(fù)方多組分分析方法的建立和應(yīng)用選取葛根中的3’-羥基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素和大豆苷,丹參中的丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮IIA,三七中的人參皂苷R_(g1)和人參皂苷R_(b1)作為質(zhì)量控制指標(biāo)建立葛根、丹參和三七復(fù)方多組分分析方法,進(jìn)樣后25min即可完成10種成分定性定量分析。0-6.5min洗脫出來(lái)的是葛根異黃酮類(lèi)成分;6.5-14min為三七總皂苷和丹酚酸B;14-25min洗脫出來(lái)的是丹參酮類(lèi)成分。將各單味藥材的RRLC圖譜輪廓(profile包含所含有的成分以及成分之間的比例關(guān)系等信息)在復(fù)方分析中得到很好地呈現(xiàn)。將該分析方法應(yīng)用于葛根、丹參和三七三種提取物的成分測(cè)定、人參屬植物(三七、人參和西洋參)的鑒別以及包含葛根、丹參和三七三種藥材中成藥制劑的檢測(cè),能有效評(píng)價(jià)相應(yīng)藥材及其復(fù)方制劑的質(zhì)量。三.葛根、丹參和三七提取物復(fù)方抗LDL-R~((-/-))倉(cāng)鼠AS的實(shí)驗(yàn)研究將成分明確的葛根、丹參和三七三種提取物通過(guò)不同配比添加飼喂用高脂飼料造模的低密度脂蛋白受體基因敲除LDL-R~((-/-))倉(cāng)鼠,將70只倉(cāng)鼠分為7組(包含模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和5個(gè)給藥組),每組10只。在給藥前、給藥4周、給藥8周和給藥12周時(shí)眼眶取血,測(cè)定血清中的總膽固醇(TC)和總甘油三酯(TG),在給藥12周后將老鼠處死,觀察藥物對(duì)LDL-R~((-/-))倉(cāng)鼠主動(dòng)脈全長(zhǎng)以及主動(dòng)脈根部管壁AS病變的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在給藥周期內(nèi),三種提取物組成的不同配方對(duì)高脂飼喂LDL-R~((-/-))倉(cāng)鼠血清中TC和TG從第8周到12周開(kāi)始幾乎均有降低趨勢(shì),且在給藥12周后,相比模型組,給藥組5(D:G:S=7:3:9)的TC和TG降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;給藥12周后,由三種提取物組成的不同配方能顯著減輕LDL-R-/-倉(cāng)鼠主動(dòng)脈全長(zhǎng)及主動(dòng)脈根部的AS病變,抗AS作用最強(qiáng)的給藥組配比為D:G:S=7:3:9。
【圖文】：

圖 1 任意兩個(gè)因素之間的交互作用二維圖由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，軟件優(yōu)化的最佳條件為乙醇濃度為 65%，溶劑使用量為 10.97 倍，提取時(shí)間為 3 小時(shí)；因素 A（乙醇濃度）和因素 B（溶劑使用量）對(duì)提取率有極顯著影響（p<0.01）。確定條件為乙醇濃度為 65%，溶劑使用量為 11 倍，提取 2 次，為了節(jié)省時(shí)間，將提取時(shí)間改為第一次3 h，第二次 2 h。2.3 溫度對(duì)提取工藝的影響分別稱(chēng)取 10 g 葛根粉末，使用前述的優(yōu)化條件分別在 60oC、70oC、80oC 水浴鍋中提�。ㄒ蕴崛∫簻囟冗_(dá)到相應(yīng)溫度時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)），經(jīng)稀釋后進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 2：表 2 不同溫度下的主要異黃酮提取量溫度（oC） 60 70 80主要異黃酮提取量（mg/g 生藥材）57.2 59.3 63.7

min 振搖 10 s, 持續(xù) 2 h,分別吸取各解吸液稀釋 100 倍后 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，，取 1μL 進(jìn)樣。比洗脫量（mg 異黃酮/g 樹(shù)脂）=洗脫液濃度 C3*洗脫液體積/樹(shù)脂量比吸附率=比洗脫量/比吸附量*100%1.4 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 3表 3 四種樹(shù)脂對(duì)葛根主要異黃酮的靜態(tài)吸附與洗脫結(jié)果（n=2）mg 主要異黃酮/g樹(shù)脂HPD100 D101 HP20 AB-8比上樣量 76.32 65.73 68.91 85.97比吸附量 61.13 50.26 53.53 71.03比洗脫量 53.81 43.95 49.16 63.60比吸附率 88.02% 87.44% 91.83% 89.53%
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2599294