發(fā)布時間：2020-03-24 19:35

【摘要】：研究目的:胃癌是一種在我國相對和絕對發(fā)病率均很高的惡性腫瘤。近年來雖然早診早治大大改善了胃癌的整體預(yù)后,但臨床進展期胃癌的綜合治療療效仍欠理想。本科室基于胃癌痰證理論創(chuàng)制的針對晚期胃癌的滋陰化痰方臨床療效肯定,但其發(fā)揮療效的分子機制尚未明確。本研究擬首先借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,預(yù)測其可能的效應(yīng)及作用機制,進而通過體內(nèi)外實驗進行驗證,以期為闡明其作用機制提供數(shù)據(jù)支持。研究方法:1.運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法查找滋陰化痰方各藥物所含的有效化學(xué)成分,并預(yù)測其潛在的抗腫瘤靶點。通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO(gene ontology)生物學(xué)過程和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,預(yù)測其治療腫瘤可能的作用途徑及作用機制。2.運用CCK-8法,探索不同濃度的滋陰化痰方對SGC-7901和MGC-803兩株胃癌細胞增殖的影響,篩選其抑制遷移和侵襲的無毒劑量。3.運用劃痕實驗和Transwell小室實驗觀察滋陰化痰方對SGC-7901和MGC-803細胞遷移和侵襲的影響。4.運用WB(Western blot)和q-PCR的方法,檢測滋陰化痰方作用于SGC-7901和MGC-803細胞后MMP2、MMP9、Snail、Slug、Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin和RUNX3等基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的潛在作用靶點的變化。5.運用CRISPR/Cas9技術(shù),將RUNX3基因敲除,并轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞后,再次通過劃痕愈合和Transwell小室實驗驗證滋陰化痰方是否通過上調(diào)RUNX3的表達發(fā)揮抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。并運用WB的方法,檢測RUNX3基因敲除后滋陰化痰方對E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9等轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響。6.構(gòu)建胃癌裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型,結(jié)合RUNX3基因敲除,觀察滋陰化痰方對胃癌細胞肺轉(zhuǎn)移能力的影響,進而運用WB和免疫組化的方法,觀察其對下游轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響。7.通過HUVECs管腔形成實驗,觀察滋陰化痰方與SGC-7901和MGC-803細胞共培養(yǎng)后上清液對HUVECs管腔形成能力的影響;通過胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,觀察滋陰化痰方對瘤體組織微血管密度的影響。8.運用ELISA、q-PCR和WB的方法,觀察滋陰化痰方對SGC-7901和MGC-803細胞及細胞上清、荷瘤裸鼠血液和瘤體組織中VEGFA和VEGFC表達水平的變化。結(jié)果:1.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示,滋陰化痰方主要可能影響包括細胞外基質(zhì)的降解、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換、細胞遷移、細胞局部粘附、基質(zhì)金屬蛋白酶活性、劃痕愈合、血管新生等在內(nèi)的GO生物學(xué)過程。2.CCK-8實驗表明,隨著滋陰化痰方濃度的不斷提高,其抑制SGC-7901和MGC-803胃癌細胞增殖的能力逐漸增強,當其濃度低于100μg/mL時,其對兩株胃癌細胞的增殖影響非常微弱,因此我們選取25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL作為下一步探究其抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機制的低、中、高劑量。3.劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果表明,隨著滋陰化痰方濃度的不斷提高,其抑制SGC-7901和MGC-803胃癌細胞遷移和侵襲的能力逐漸增強。4.WB和q-PCR的結(jié)果表明,滋陰化痰方能夠抑制MMP2、MMP9、N-Cadherin和Vimentin的表達,并上調(diào)RUNX3和E-Cadherin的表達,但對Snail和Slug表達作用不顯著。5.運用CRISPR/Cas9技術(shù),成功構(gòu)建SGC-7901-RUNX3~(-/-)穩(wěn)定株,劃痕愈合和Transwell小室實驗結(jié)果表明,滋陰化痰方能夠通過上調(diào)RUNX3的表達抑制胃癌侵襲遷移;WB實驗結(jié)果表明,與SGC-7901正常組細胞相比,滋陰化痰方干預(yù)SGC-7901-RUNX3~(-/-)細胞的E-Cadherin的蛋白表達量下調(diào),而N-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的蛋白表達量升高。6.以SGC-7901和SGC-7901-RUNX3~(-/-)細胞成功建立胃癌裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型,體內(nèi)實驗結(jié)果表明,相比生理鹽水空白對照組,滋陰化痰方可明顯抑制模型小鼠的肺轉(zhuǎn)移能力;在RUNX3基因敲除后,再次給予滋陰化痰方干預(yù),其抑制胃癌細胞肺轉(zhuǎn)移的能力也相應(yīng)減弱。與正常組相比,模型小鼠給予滋陰化痰方干預(yù)后生存時間明顯延長;WB和免疫組化的結(jié)果表明,滋陰化痰方干預(yù)RUNX3基因敲除后肺轉(zhuǎn)移小鼠的E-Cadherin的蛋白表達量明顯下調(diào),而N-Cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的蛋白表達量則明顯升高。7.HUVECs管腔形成實驗表明,滋陰化痰方可明顯抑制HUVECs的管腔形成能力;裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明,滋陰化痰方能夠降低裸鼠皮下移植瘤瘤體組織的微血管密度,抑制瘤體內(nèi)微血管的形成。8.ELISA、q-PCR和WB實驗結(jié)果表明,滋陰化痰方能夠降低SGC-7901和MGC-803細胞及細胞上清、荷瘤裸鼠血液和瘤體組織中VEGFA和VEGFC的表達。結(jié)論:1.滋陰化痰方在體內(nèi)外具有抑制胃癌的侵襲和遷移的作用,該作用與其上調(diào)RUNX3的表達相關(guān)。2.滋陰化痰方在體內(nèi)外具有抗胃癌血管新生的作用,該作用可能與其抑制胃癌細胞和荷瘤小鼠VEGFA和VEGFC表達有關(guān)。
【圖文】：

圖 1-1 滋陰化痰方的成分-抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)圖nteraction networks of compounds -antitumor targets of ZYHesents compound of ZYHT and the blue circle represents the an滋陰化痰方潛在抗腫瘤靶點通路注釋分析生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫 DAVID，對滋陰化痰方所有潛在及信號通路分析進行展現(xiàn)和富集分析，得到滋陰化痰方的中包括對藥物的反應(yīng)、細胞遷移、細胞外基質(zhì)的降解、血導(dǎo)的調(diào)節(jié)在內(nèi)的 58 個生物學(xué)過程，詳見表 1-3，圖 1-2。表 1-3 滋陰化痰方潛在抗腫瘤靶點 GO 生物學(xué)功能分析結(jié)Term Count Ratresponse to drug 34 16.

圖 1-2 滋陰化痰方潛在抗腫瘤靶點 GO 生物學(xué)功能分析結(jié)果Figure 1-2. Gene ontology analysis on potential effective anti-tumor targets of ZYHT滋陰化痰方富集的 KEGG 通路有 127 個，，其中有包括 HIF-1、TNF 信號通路、局部粘附（Focaladhesion）、黏著連接（Adherens junction）、VEGF 信號通路等在內(nèi)的 46個 KEGG 通路有顯著意義，詳見表 1-4, 圖 1-3。表 1-4 滋陰化痰方潛在抗腫瘤靶點 KEGG 通路分析ID Term Count Ratio P valuehsa05200 Pathways in cancer 46 22.12 1.21×10-17hsa05215 Prostate cancer 20 9.62 9.27×10-13hsa05219 Bladder cancer 14 6.73 2.15×10-11hsa04066 HIF-1 signaling pathway 19 9.13 4.74×10-11hsa04668 TNF signaling pathway 19 9.13 3.11×10-10hsa05205 Proteoglycans in cancer 25 12.02 4.48×10-10
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2598760