【摘要】：近年來(lái),阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者數(shù)量呈持續(xù)上升趨勢(shì),平均每3秒全球增加一名AD患者,而我國(guó)是全球增長(zhǎng)速度最快的國(guó)家。但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、靶點(diǎn)多樣,治療仍是難點(diǎn)。中藥多成分、多靶點(diǎn)的特色已成為治療AD的首選,與靶點(diǎn)明確的西藥聯(lián)用不僅療效顯著而且降低不良反應(yīng)。經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn),臨床上最常用的是將銀杏酮酯和多奈哌齊聯(lián)用,但兩藥聯(lián)用的量效關(guān)系和作用機(jī)制尚不明確。因此本論文以銀杏酮酯-多奈哌齊為研究對(duì)象,結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)和藥學(xué)評(píng)價(jià)手段對(duì)其進(jìn)行量效關(guān)系和物質(zhì)基礎(chǔ)研究,運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行探究。第一章文獻(xiàn)研究本章系統(tǒng)綜述了阿爾茨海默病的現(xiàn)代研究狀況、中西醫(yī)結(jié)合治療的現(xiàn)狀以及臨床常用藥銀杏酮酯-多奈哌齊聯(lián)合應(yīng)用的進(jìn)展。第二章銀杏酮酯-多奈哌齊兩藥聯(lián)用抗阿爾茨海默病的量效關(guān)系研究第一節(jié)不同劑量的銀杏酮酯-多奈哌齊抗阿爾茨海默病效應(yīng)研究本節(jié)采用多因素?fù)p傷復(fù)制小鼠癡呆模型,給予不同劑量的銀杏酮酯-多奈哌齊(G、D、GD 0.5 ×、GD 1 ×、GD 2 ×、GD 4 ×、GD6×、GD8×、GD 10×)進(jìn)行治療后,通過(guò)觀察Morris水迷宮行為學(xué)、分析腦組織病理切片和腦、血漿中神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)酶指標(biāo)的變化來(lái)評(píng)價(jià)藥效,再結(jié)合多指標(biāo)綜合指數(shù)法和主成分分析(PCA)篩選兩藥聯(lián)用的最佳劑量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組的行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)及其酶含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01或P0.05);與模型組比較,不同劑量給藥組對(duì)各指標(biāo)有一定改善作用,且改善效果不一。綜合多指標(biāo)綜合指數(shù)和PCA得出:GD 1 ×GD 0.5 ×GD 2 ×GD 6 ×DGD 4 ×GGD 8 ×GD 10 ×,表明銀杏酮酯-多奈哌齊臨床1倍量(GD 1 ×)時(shí)效果最佳。第二節(jié)不同配比的銀杏酮酯-多奈哌齊抗阿爾茨海默病效應(yīng)研究基于優(yōu)選的最佳劑量對(duì)銀杏酮酯-多奈哌齊不同配比(GD 1:0、GD 2:1、GD 3:1、GD 4:1、GD 8:1、GD 1:1、GD 1:8、GD 1:4、GD 1:3、GD 1:2和GD 0:1)進(jìn)行研究,依次對(duì)Morris水迷宮、腦病理切片和血腦中神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)酶的變化進(jìn)行分析,結(jié)合多指標(biāo)綜合指數(shù)法和PCA篩選兩藥聯(lián)用的最佳配比。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組各指標(biāo)都表現(xiàn)出顯著性差異(P0.01或P0.05);與模型組比較發(fā)現(xiàn),不同配比給藥組對(duì)各指標(biāo)有一定回調(diào)作用(P0.01或P0.05)。綜合多指標(biāo)綜合指數(shù)法和PCA得出:GD 1:1GD 1:2GD 1:3GD 0:1GD 1:0GD 2:1GD 1:4GD 1:8GD 3:1GD 8:1GD 4:1,表明兩藥在一定范圍內(nèi)起配伍增效作用,其中銀杏酮酯-多奈哌齊1:1時(shí)(GD 1:1)效果最佳。第三章基于“腦-腸-腸道菌群”軸的銀杏酮酯-多奈哌齊抗阿爾茨海默病聯(lián)用增效的體內(nèi)、外過(guò)程研究第一節(jié)銀杏酮酯-多奈哌齊兩藥聯(lián)用在模型小鼠組織和血液中的分布研究基于前期篩選出的最佳配比(1:1),本節(jié)對(duì)單用和聯(lián)用后成分進(jìn)行追蹤評(píng)價(jià)分析。在多因素?fù)p傷致小鼠癡呆模型復(fù)制完成后,連續(xù)給藥10天,通過(guò)UHPLC-MS/MS檢測(cè)38種成分在模型小鼠腦、腸、腸內(nèi)容物和血漿中含量分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),多奈哌齊、金松雙黃酮、蘆丁等成分在聯(lián)用后在腦中的含量升高,推測(cè)藥物聯(lián)用后促進(jìn)這些成分透過(guò)血腦屏障的能力發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。黃酮類成分在體內(nèi)各組織和血液中均有分布;黃酮苷類成分和銀杏酸類成分在體內(nèi)分布較少;內(nèi)酯類成分僅在腸內(nèi)容物中檢測(cè)到。第二節(jié)銀杏酮酯中特征成分的體外胃腸道代謝研究本節(jié)建立體外模擬人腸道菌代謝技術(shù),采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)銀杏酮酯特征性成分(槲皮素-3-O-α-L-(6'"-p-香豆酰葡萄糖基-β-D-1,2-鼠李糖苷))在正常和病理狀態(tài)下不同時(shí)間段的腸道菌群中代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,以期尋找正常和病理狀態(tài)下的代謝差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常和病理狀態(tài)下主要有以下幾種差異:(1)代謝反應(yīng)發(fā)生時(shí)間差異;(2)代謝反應(yīng)類型存在差異;(3)代謝產(chǎn)物種類差異。第四章基于“腦-腸-腸道菌群”軸的銀杏酮酯-多奈哌齊抗阿爾茨海默病聯(lián)用增效的機(jī)理研究第一節(jié)銀杏酮酯-多奈哌齊聯(lián)用對(duì)阿爾茨海默病鼠的腸道菌群組成譜影響越來(lái)越多的研究表明腸道菌參與AD的發(fā)病,基于此,本節(jié)采用16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)考察癡呆小鼠體內(nèi)腸道菌群的改變及銀杏酮酯-多奈哌齊單用和聯(lián)用給藥后對(duì)癡呆小鼠腸道菌群多樣性的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組小鼠腸道菌的豐富度和多樣性降低,其中厚壁菌門、放線菌門、乳酸桿菌屬和埃希氏菌屬的豐度顯著降低(P0.01或P0.05);擬桿菌門、變形菌門和鏈球菌屬的豐度顯著增加(P0.01或P0.05)。給藥治療后,不同程度的改善了模型鼠體內(nèi)菌群的豐度,表明銀杏酮酯-多奈哌齊聯(lián)用后通過(guò)提高益生菌數(shù)量來(lái)改善模型鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮增效作用機(jī)制。第二節(jié)腦腸肽信號(hào)分子調(diào)節(jié)作用的銀杏酮酯-多奈哌齊抗阿爾茨海默病聯(lián)用增效的機(jī)理研究本節(jié)采用蛋白免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)正常組、模型組、銀杏酮酯-多奈哌齊聯(lián)用組小鼠的腦、腸中乙酰膽堿酯酶(Acetyl cholinesterase,AChE)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)、單胺氧化酶B(Monoamine oxidase b,MAO-b)、血管活性腸肽(Vasoactive intestinal polypeptide,VIP)、P物質(zhì)(Substance P,SP)和神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y,NPY)的蛋白含量和mRNA基因表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,模型組小鼠腦、腸中的這些指標(biāo)蛋白含量和mRNA表達(dá)均有顯著性差異;與模型組比較,給藥后腦腸中的MAO-b和VIP蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)有顯著的回調(diào)作用(P0.01或P0.05),其余各指標(biāo)表現(xiàn)出相應(yīng)回調(diào)的趨勢(shì)。提示銀杏酮酯-多奈哌齊聯(lián)用組可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些相關(guān)指標(biāo)蛋白含量和mRNA表達(dá)發(fā)揮增效作用,尤其是MAO-b和VIP的改善效果最明顯。第三節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用的銀杏酮酯-多奈哌齊抗阿爾茨海默病聯(lián)用增效的機(jī)理研究本節(jié)首次建立UHPLC-MS/MS在6 min內(nèi)對(duì)正常組、模型組、銀杏酮酯組、多奈哌齊組和聯(lián)用組小鼠的腦、腸、腸內(nèi)容物和血漿中的15個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)類成分進(jìn)行含量測(cè)定,以期來(lái)探究聯(lián)用增效的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),L-谷氨酸為代表的興奮性氨基酸在模型小鼠腦、腸中大量釋放,對(duì)神經(jīng)元造成損傷;有保護(hù)神經(jīng)元作用的抑制性氨基酸(γ-氨基丁酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸和牛磺酸)和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(腎上腺素,多巴胺、5-羥色胺和去甲腎上腺素)在模型小鼠的腦、腸中釋放較少;此外,神經(jīng)遞質(zhì)的代謝產(chǎn)物(5-羥基吲哚乙酸和高香草酸)和其他類別的神經(jīng)遞質(zhì)在模型小鼠體內(nèi)釋放含量異常,與正常組相比表現(xiàn)出顯著性差異。給藥之后,與模型組相比,有一定的治療作用。表明銀杏酮酯-多奈哌齊可能是通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)在各組織的釋放來(lái)達(dá)到增效作用的。第四節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子調(diào)節(jié)作用的銀杏酮酯-多奈哌齊抗阿爾茨海默病聯(lián)用增效的機(jī)理研究本節(jié)采用多因素?fù)p傷致癡呆模型和東莨菪堿誘導(dǎo)記憶障礙模型,探討神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在增效治療AD中的作用。通過(guò)蛋白免疫印跡法對(duì)正常、模型和給藥小鼠BDNF的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在多因素?fù)p傷模型中,模型鼠腦和腸中的BDNF蛋白含量明顯降低(P0.05),給藥后小鼠有回調(diào)趨勢(shì),但未見(jiàn)顯著性差異;在東莨菪堿誘導(dǎo)的模型中,模型鼠腦中的BDNF和TrkB蛋白含量明顯下降(P0.001),給藥后有明顯升高的趨勢(shì),且與模型組有顯著性差異。提示,銀杏酮酯-多奈哌齊可能通過(guò)對(duì)BDNF-TrkB通路的調(diào)控作用起到聯(lián)用增效的作用。本論文首先建立了多因素?fù)p傷癡呆模型,對(duì)銀杏酮酯和多奈哌齊兩藥聯(lián)用不同量比抗AD關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用最佳配比為GD1:1臨床等效量效果最佳;接著運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù),從體內(nèi)藥物分布變化及體外腸道菌群孵育差異探討銀杏酮酯-多奈哌齊兩藥聯(lián)用的物質(zhì)基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)多奈哌齊、金松雙黃酮、蘆丁、咖啡酸和綠原酸可以增強(qiáng)透過(guò)血腦屏障的能力發(fā)揮增效作用;最后基于腸道菌組成譜、腦腸肽分子、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4個(gè)方面對(duì)兩藥聯(lián)用機(jī)制進(jìn)行了初步探索,發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用后顯著提高腸道菌中益生菌數(shù)量,這些益生菌釋放或抑制一部分腦腸肽分子和神經(jīng)遞質(zhì),它們進(jìn)一步通過(guò)腸神經(jīng)系統(tǒng)間接作用于大腦。
【圖文】：

圖１－１－ｈ邋２０１８年美國(guó)６５歲及以上老年人患有阿爾茨海默病或其他癡呆癥的護(hù)理總費(fèi)用分逡逑

圖２－１－２各組小鼠定位航行軌跡圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１－２邋Ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ邋ｍａｐｓ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｍｉｃｅ逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2596958