【摘要】：天然黃酮類化合物(Natural flavonoids)普遍存在于水果、蔬菜、茶、葡萄酒、種子或是植物根中,具有抗病毒、抗氧化、心血管保護(hù)和抗癌作用。容積激活氯離子通道(Volume-regulated anion channels,VRACs)組織分布廣泛,在維持細(xì)胞容積和離子平衡方面發(fā)揮重要作用,并參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程,在跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)和癌癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用。VRACs通道阻斷劑可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成與重構(gòu)以及腫瘤的發(fā)展,故開發(fā)高效、特異性的VRACs阻斷劑具有很高的價值。因此本實(shí)驗(yàn)的研究目的是探索VRACs通道高特異性阻斷劑,并初步研究黃酮類化合物調(diào)節(jié)血管生成的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(whole cell patch clamp technique)記錄人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的VRACs電流,檢測黃酮類化合物對VRACs通道調(diào)節(jié)作用及選擇性研究,并采用5'-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)測定技術(shù)研究黃酮類化合物對HUVEC細(xì)胞增殖的影響。本研究主要包括以下兩部分:(1)天然和人工合成黃酮類化合物對容積激活氯離子通道的調(diào)節(jié)作用;(2)人工合成黃酮類化合物黃酮哌酯(Flavoxate)及其代謝產(chǎn)物3-甲基黃酮-8-羧酸(3-methylflavone-8-carboxylic acid,MFCA)對容積激活氯離子通道(VRACs)、TMEM16A編碼的Ca~(2+)激活Cl~-通道(Calcium-activated chloride channels,TMEM16A/CaCCs)的調(diào)節(jié)作用及選擇性研究。第一部分天然和人工合成黃酮類化合物對VRACs通道的調(diào)節(jié)作用目的:探討天然和人工合成黃酮類化合物對VRACs通道的調(diào)節(jié)作用以及調(diào)節(jié)血管生成的機(jī)制。方法:采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄天然和人工合成黃酮類化合物對低滲外液激活的HEK293和HUVEC細(xì)胞中的VRACs電流的影響,并利用BrdU技術(shù)檢測藥物對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:1.天然黃酮類化合物對HEK293細(xì)胞中VRACs電流的影響100μM時,53種黃酮類化合物中有34種對VRACs電流的抑制率大于50%,其中木犀草素(luteolin),黃芩素(baicalein),半齒澤蘭素(eupatorin),高良姜素(galangin),槲皮素(quercetin),漆黃素(fisetin),水黃皮素(karanjin),二氫桑色素(Dh-morin),染料木素(genistein),葛花苷元(irisolidone)和櫻黃素(prunetin)的抑制率最高(抑制率均大于80%)。2.天然黃酮類化合物對HEK293細(xì)胞VRACs電流量效關(guān)系曲線的影響我們在-100 mV電壓下記錄了不同濃度的藥物對VRACs電流的影響,并建立了量效關(guān)系曲線。結(jié)果顯示,其IC_(50)s范圍為5-13μM,E_(max)s范圍為87-99%。3.天然黃酮類化合物對HEK293細(xì)胞VRACs電流-電壓(I-V)關(guān)系曲線的影響我們觀察了3μM和30μM的藥物以及10μM DCPIB對VRACs通道I-V關(guān)系曲線的影響,結(jié)果說明這些藥物能濃度依賴性地抑制VRACs電流,但并不影響其翻轉(zhuǎn)電位。4.天然黃酮類化合物對HUVEC細(xì)胞VRACs電流的影響與在HEK293細(xì)胞中觀察到的藥物對VRACs電流結(jié)果一致,100μM的luteolin,baicalein,galangin,quercetin,fisetin和genistein以及10μM DCPIB能顯著性地抑制HUVEC細(xì)胞中VRACs電流。而flavone(黃酮),herbacetin(草質(zhì)素),daidzein(大豆苷元),genistin(染料木苷)和catechin(兒茶素)對HUVEC細(xì)胞中的VRACs電流的抑制作用較弱。5.天然黃酮類化合物對HUVEC細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示,對VRACs電流抑制作用較強(qiáng)的11種天然黃酮類化合物(除Dh-morin外)可顯著抑制HUVEC細(xì)胞增殖。6.人工合成黃酮類化合物對HEK293細(xì)胞VRACs電流的影響100μM時,flavoxate,alovcidib和diosimin可顯著抑制VRACs電流,抑制率分別為87.84±0.86%;71.33±1.31%;56.98±5.12%,其中flavoxate對VRACs電流抑制作用最強(qiáng)。7.Flavoxate對HEK293細(xì)胞VRACs電流量效關(guān)系曲線及電流-電壓(I-V)關(guān)系曲線的影響我們建立了flavoxate調(diào)節(jié)HEK293細(xì)胞中VRACs電流的量效關(guān)系曲線,其IC_(50)為2.25±0.30μM,E_(max)為91.81±2.74%。我們觀察了3μM和30μM的flavoxate以及10μM的DCPIB對VRACs電流的I-V關(guān)系曲線的調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)flavoxate能顯著抑制VRACs電流,但不影響其翻轉(zhuǎn)電位。第二部分人工合成黃酮類化合物黃酮哌酯及其活性代謝產(chǎn)物對VRACs通道的選擇性研究目的:探討Flavoxate及其活性代謝產(chǎn)物MFCA對VRACs通道的選擇性作用。方法:采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄flavoxate及活性其代謝產(chǎn)物MFCA對VRACs及TMEM16A/CaCCs的選擇性作用。結(jié)果:1.實(shí)驗(yàn)中所記錄的電流為鈣激活氯離子電流當(dāng)鈣離子通過電極尖端進(jìn)入細(xì)胞膜后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度不斷增加會逐漸激活電流,此時細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度為384 nM,因此確定所記錄電流為鈣激活氯離子電流,當(dāng)電流趨于平穩(wěn)后即可給藥。2.Flavoxate及MFCA對VRACs的調(diào)節(jié)性作用100μM時flavoxate能顯著抑制低滲外液激活的VRACs電流,抑制率為89.43±0.92%;同樣100μM時MFCA也能顯著抑制VRACs電流,抑制率為72.62±1.58%。3.Flavoxate及MFCA對TMEM16A/CaCCs的調(diào)節(jié)性作用100μM時flavoxate對TMEM16A/CaCCs電流的抑制率約為35%。通過觀察30μM flavoxate及MFCA對TMEM16A/CaCCs電流的I-V曲線的影響發(fā)現(xiàn):flavoxate及MFCA均能抑制TMEM16A/CaCCs電流。30μM時flavoxate對TMEM16A/CaCCs電流的抑制作用較弱,抑制率為21.11±2.74%;同樣30μM時MFCA對TMEM16A/CaCCs電流的抑制作用也較弱,抑制率為19.25±2.30%。結(jié)論:1.天然和人工合成黃酮類化合物可以顯著抑制VRACs通道電流,這些藥物可能通過阻斷VRACs通道電流進(jìn)而達(dá)到抑制血管生成的作用。2.Flavoxate及其活性代謝產(chǎn)物MFCA對VRACs通道具有較高選擇性。
【學(xué)位授予單位】：河北中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙雪巍;劉培玉;劉丹;孫珊珊;李貞;余可馨;張Z誒，

本文編號：2596054