【摘要】：背景 HIF-1α是腦缺血后缺血半暗帶內(nèi)細胞廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控缺氧下細胞存活以及新血管形成。但該因子在腦缺血后出芽式血管新生關(guān)鍵步驟——tip細胞形成以及血管發(fā)生關(guān)鍵步驟——內(nèi)皮祖細胞(EPCs)歸巢的影響尚不清楚。梓葛凍干粉針為本實驗室創(chuàng)制的中藥單體復(fù)方新藥,由梓醇和葛根素兩種中藥單體配伍組成。前期研究表明梓葛凍干粉針具有顯著的抗腦缺血作用,包括減輕神經(jīng)功能損傷、減小腦梗死體積、減輕腦水腫等。梓葛凍干粉針是否對缺血損傷的關(guān)鍵靶點腦血管具有保護作用,以及是否具有促進缺血后新血管形成作用尚不清楚。目的1.觀察HIF-1α在腦缺血后血管新生過程中對促進tip細胞形成及EPCs歸巢的作用;2.觀察梓葛凍干粉針對腦血管缺血損傷的保護作用和促新血管新生作用;并探索其作用機制。方法與結(jié)果1.HIF-1α在腦缺血后新血管形成中的作用機制研究方法(1)采用電凝法制備大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。造模成功標準:缺血梗死中心區(qū)域血流量(r CBF)下降80%及以上;m NSS評分為3-8分。造模成功的MCAO大鼠分為:control sh RNA組、HIF-1αsh RNA組。(2)缺血7天,觀察缺血區(qū)血管分支及微小血管(直徑㩳20 mm)數(shù)量;免疫熒光染色觀察腦內(nèi)tip細胞數(shù)量;Western blot、免疫熒光染色檢測腦內(nèi)EPCs歸巢、血管表達量以及星形膠質(zhì)細胞數(shù)量。(3)缺血7天,免疫熒光染色觀察敲降腦內(nèi)HIF-1α表達對內(nèi)源性EPCs在腦內(nèi)歸巢的影響。(4)缺血14天,評價大鼠神經(jīng)功能損傷、梗死區(qū)周圍血流量、腦梗死體積、梗死區(qū)周圍血管密度。(5)原代骨髓源EPCs經(jīng)Brd U標記后注入MCAO大鼠體內(nèi),梗死后第7天觀察敲降腦內(nèi)以及EPCs HIF-1α對外源性EPCs歸巢的影響;第10天觀察外源性EPCs融合入血管壁以及Dll4表達情況。(6)2%O2條件下,觀察敲降HIF-1α對EPCs小管形成、細胞球出芽,以及EPCs出芽、歸巢相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果 慢病毒介導(dǎo)sh RNA轉(zhuǎn)染顯著抑制大鼠缺血腦組織內(nèi)HIF-1α表達及血管出芽和EPCs歸巢。(1) 導(dǎo)致腦損傷加重。缺血14天,敲降大鼠腦內(nèi)HIF-1α表達,導(dǎo)致腦梗死體積、m NSS評分顯著增加,r CBF(腦血流)顯著降低。(2)導(dǎo)致腦缺血區(qū)新血管形成障礙。缺血14天,敲降大鼠腦內(nèi)HIF-1α表達,導(dǎo)致缺血周圍血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)形成障礙、微血管密度降低。(3)導(dǎo)致血管出芽新生減少。腦缺血7天,敲降大鼠腦內(nèi)HIF-1α表達,導(dǎo)致缺血區(qū)皮層血管分支數(shù)量、微小血管(直徑㩳20 mm)數(shù)量顯著減少;腦內(nèi)tip細胞(血管頂細胞)顯著減少。(4)導(dǎo)致EPCs介導(dǎo)的血管新生障礙。腦缺血7天,敲降腦內(nèi)HIF-1α表達,導(dǎo)致腦內(nèi)內(nèi)源性EPCs歸巢數(shù)量減少;抑制腦內(nèi)或外源性EPCs HIF-1α表達,均導(dǎo)致外源性EPCs歸巢、融合入原位血管、以及Dll4表達水平顯著降低。2%O2條件下,敲降HIF-1α表達,導(dǎo)致EPCs小管形成、細胞球出芽數(shù)量顯著減少;導(dǎo)致EPCs出芽相關(guān)蛋白VEGF、Dll4、NRP1、Flk1表達降低。(5)導(dǎo)致EPCs歸巢以及出芽式血管新生微環(huán)境受損。腦缺血7天,敲降腦內(nèi)HIF-1α表達,導(dǎo)致腦內(nèi)CXCL12/CXCR4、HMGB1、VEGF-A、p ERK、Flk1表達量及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著降低。在2%O2條件下,敲降HIF-1α表達,導(dǎo)致EPCs上CXCR4、星形膠質(zhì)細胞上CXCL12和HMGB1表達降低。(均p㩳0.05)2.梓葛凍干粉針基于HIF-1α對BMECs缺血損傷的抗凋亡作用及機制研究 2.1原代腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)、鑒定方法(1)采用掃描電鏡、透射電鏡觀察腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)形態(tài)和細胞緊密連接結(jié)構(gòu);采用免疫標記物對細胞進行免疫表型鑒定,并對可能的雜細胞種類及污染程度進行鑒定;血管內(nèi)皮細胞功能鑒定包括:TEER檢測、小管形成。(2)采用OGD+LON構(gòu)建體外缺血半暗帶模型:OGD(氧糖剝奪損傷)損傷BMECs 20小時,再將細胞置于LON(低氧、低營養(yǎng)培養(yǎng)條件:20%血清培養(yǎng)基稀釋4倍、2%O2)下繼續(xù)培養(yǎng)。MTT檢測細胞活性,評價模型對細胞的損傷情況。結(jié)果(1)原代腦血管內(nèi)皮細胞(BMECs)純度達99%以上。掃描電鏡、透射電鏡、內(nèi)皮細胞功能以及多個血管內(nèi)皮細胞標記物染色結(jié)果表明,培養(yǎng)的細胞具有血管內(nèi)皮細胞特征;且細胞純度高,大于99%。(2)OGD+LON具有缺血半暗帶損傷特征。那微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)經(jīng)OGD損傷20小時存活率約70%;繼續(xù)LON培養(yǎng)12小時,細胞存活率約70%左右;16小時下降至62%;28小時降至29%。表明經(jīng)OGD損傷的BMECs在LON培養(yǎng)下可以在有限的時間里存活,與缺血半暗帶內(nèi)細胞存活情況相似。(均p㩳0.05)2.2自主構(gòu)建腦缺血半暗帶血管損傷體外模型方法(1)采用電凝法制備MCAO大鼠,并將造模成果的大鼠隨機分組:MCAO組、梓葛凍干粉針各劑量組(65.4 mg/kg、32.7 mg/kg、16.4 mg/kg)。采用隨機數(shù)字表分組后對各組大鼠腦血流(r CBF)和m NSS評分進行統(tǒng)計分析,確認各組有無顯著差。(2)給藥4天,觀察缺血側(cè)大腦血管形態(tài)、血管內(nèi)皮細胞凋亡。給藥7天,檢測大鼠腦內(nèi)HIF-1α蛋白量。(3)給藥14天,檢測大鼠神經(jīng)功能損傷(m NSS評分)、腦梗死體積以及腦血流(r CBF)。(4)體外研究:采用OGD、OGD+LON模型,觀察梓葛凍干粉針(24.5μg/m L、49μg/m L和98μg/m L)對BMECs細胞活性、凋亡的影響;采用OGD+LON模型,觀察梓葛凍干粉針對BMECs HIF-1α表達及入核的影響;以及敲降HIF-1α對藥物促細胞存活作用、抗凋亡的影響;采用阻斷劑抑制ERK或m TOR,觀察梓葛凍干粉針對HIF-1α表達、BMECs存活的影響。結(jié)果(1)梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠具有抗腦缺血損傷作用。給藥14天,梓葛凍干粉針65.4 mg/kg顯著降低腦梗死體積;梓葛凍干粉針(65.4 mg/kg、32.7 mg/kg)顯著增加梗死灶周圍血流量。(2) 梓葛凍干粉針對血管內(nèi)皮細胞具有顯著抗凋亡作用。動物實驗:給藥4天,梓葛凍干粉針(65.4 mg/kg,32.7 mg/kg)顯著改善MCAO大鼠血管損傷形態(tài)、減少凋亡BMECs數(shù)量。細胞實驗:與OGD+LON組比較,梓葛凍干粉針49μg/m L、98μg/m L組細胞活性顯著升高;梓葛凍干粉針49μg/m L顯著抑制線粒體Cyt-c釋放,減少Bax、Bad、cleaved-Caspase3,增加Bcl-2表達量。(3)梓葛凍干粉針抗凋亡作用依賴于HIF-1α。給藥7天,梓葛凍干粉針65.4mg/kg、32.7 mg/kg顯著增加MCAO大鼠腦內(nèi)HIF-1α表達。細胞實驗表明,梓葛凍干粉針(49μg/m L)能促進BMECs HIF-1α表達和入核;敲降HIF-1α表達,導(dǎo)致梓葛凍干粉針促細胞存活、抗細胞凋亡作用顯著減弱。(4)梓葛凍干粉針抗凋亡作用及上調(diào)HIF-1α表達依賴于ERK和PI3K/AKT/m TOR。細胞實驗表明,抑制m TOR通路或者ERK通路均導(dǎo)致梓葛凍干粉針(49μg/m L)上調(diào)HIF-1α表達、促細胞存活、抗細胞凋亡作用減弱。(均p㩳0.05)3.梓葛凍干粉針基于HIF-1α對腦缺血大鼠腦血管內(nèi)皮細胞保護作用及機制研究方法(1)MCAO大鼠模型制備及篩選同第一章,動物分組同第三章。(2)術(shù)后,采用Brd U(50 mg/kg)標記新生細胞。給藥7天,采用免疫熒光觀察各組tip細胞(v WF/Dll4)、EPCs(CD34/Flk1)、CD31/Brd U數(shù)量,以及VEGF、HMGB1表達量;給藥14天,免疫熒光標記CD31計數(shù)微血管密度;WB檢測腦組織中VEGF和Ang2表達量。(3)在低氧、低營養(yǎng)培養(yǎng)條件下觀察梓葛凍干粉針(49μg/m L)對BMECs小管形成、細胞增殖以及細胞遷移的影響。sh RNA敲降HIF-1α后,觀察藥物作用是否受到影響。結(jié)果(1)梓葛凍干粉針促進腦缺血后新血管形成。給藥14天,與MCAO組相比,梓葛凍干粉針65.4 mg/kg組、32.7 mg/kg組微血管密度顯著增加。(2)梓葛凍干粉針促進腦缺血后tip細胞形成和內(nèi)皮祖細胞歸巢。給藥7天,與MCAO組相比,梓葛凍干粉針65.4 mg/kg組v WF/Dll4、CD34/Flk1、VEGF+細胞顯增多,HMGB1表達顯著增多。(3)梓葛凍干粉針促進體外血管新生作用依賴于HIF-1α。與LON(低氧、低營養(yǎng))組相比,梓葛凍干粉針49μg/m L組腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)小管形成、Brd U+細胞、細胞遷移顯著增加;與梓葛凍干粉針+control sh RNA組相比,梓葛凍干粉針+HIF-1αsh RNA組腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)小管形成、細胞遷移顯著減弱,Brd U陽性細胞數(shù)量無顯著差異。(均p㩳0.05)結(jié)論1.本實驗結(jié)果顯示,HIF-1α是維持腦缺血后損傷神經(jīng)功能自我修復(fù)、新血管再生的關(guān)鍵因子。HIF-1α通過調(diào)控新血管生成微環(huán)境促進tip細胞的形成和EPCs的歸巢,從而促進出芽式血管新生和血管發(fā)生。2.自創(chuàng)的體外缺血半暗帶模型(OGD+LON)具有一定的缺血半暗帶BMECs損傷特征,能作為缺血半暗帶體外研究載體。3.梓葛凍干粉針對缺血損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞具有顯著抗凋亡作用。作用機制為通過激活ERK和PI3K/AKT/m TOR上調(diào)HIF-1α表達,從而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。4.梓葛凍干粉針能促進大鼠腦缺血后新血管形成,其作用可能與上調(diào)HIF-1α表達、促進tip細胞形成和EPCs歸巢相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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2 張勝;秦竹;熊洪艷;馬鳳麗;;葛根與生地黃配伍探析[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2009年07期

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本文編號：2591109