【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球主要的慢性肝病,不僅在中國、日本等亞洲國家,而且在大多數(shù)西方發(fā)達國家中都越來越普遍,并且與肥胖,糖尿病和代謝綜合征密切相關。NAFLD可發(fā)展成非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、進行性肝纖維化,最終可發(fā)展成肝硬化和肝癌。然而,該疾病發(fā)病機制復雜,目前仍未得到很好的闡明。由于門靜脈系統(tǒng)可將腸腔與肝臟的結(jié)構和功能緊密聯(lián)系,研究已發(fā)現(xiàn)并證實腸道菌群在NAFLD的發(fā)病機理中起關鍵作用。此外,飲食可顯著調(diào)節(jié)腸道微生物組和NAFLD發(fā)展相關的代謝途徑,表明腸道、飲食和肝臟之間也密切相關。其主要表現(xiàn)有,受不同類型飲食習慣的影響,腸道菌群代謝物如乙醇、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的生產(chǎn)水平可發(fā)生顯著變化,直接或間接地影響著機體肝臟組織表型變化,參與單純性肝脂肪變性、NASH、肝硬化等各個病理階段。這也為NAFLD臨床防治提供了一個新思路。此前,已有報道表明,從貽貝當中提取出來的生物多糖(mussel polysaccharides,MPs)具有多種生物活性,如調(diào)節(jié)免疫力、調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗腫瘤等作用。前期工作中,課題組從貽貝中提取出一種新型貽貝多糖“α-D-葡聚糖”(mussel polysaccharide α-D-Glucan,MP-A),并在預實驗中發(fā)現(xiàn)MP-A有調(diào)節(jié)肝臟TG水平的作用,推測其可能對NALFD具有防治作用,然而至今未見任何一種MPs在此方面的報道。本課題將結(jié)合腸道菌群在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用機制,使用高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導法構建體內(nèi)動物模型,研究MP-A對NAFLD的藥效作用及探究其機制,為其開發(fā)和臨床應用提供理論支持。1 MP-A對高脂飲食大鼠的肝保護作用目的:通過體內(nèi)實驗評價MP-A對HFD誘導的NAFLD模型大鼠的肝保護作用。方法:使用HFD誘導法構建NAFLD模型大鼠。42只大鼠隨機分成6組:正常組、HFD組、MP-A(110 mg/kg)組、MP-A(300 mg/kg)組、MP-A(600 mg/kg)組、血脂康組,每組6只。除正常組外,其余大鼠均喂食高脂飼料。每周測量一次體重和攝食量。從第3周起,各實驗處理組開始灌胃給藥,正常組和HFD組灌胃相同體積的溶劑。在第8周結(jié)束時,對各組大鼠進行麻醉采血,然后處死。對各組大鼠的攝食量、體重、肝重、血脂水平、肝臟甘油三酯(triglyceride,TG)水平及肝臟病理情況進行分析評估。結(jié)果:MP-A可在不影響攝食量的情況下,顯著地減緩大鼠體重增長速率和降低血脂水平,并與給藥劑量呈正相關。此外,MP-A可顯著降低NAFLD模型大鼠的相對肝重和肝臟TG水平,有效緩解HFD大鼠肝臟的脂質(zhì)沉積。結(jié)合大體標本的肉眼觀察結(jié)果,我們可進一步確定MP-A對HFD大鼠肝脂肪變性緩解作用。其中,MP-A劑量為100 mg/kg時,大鼠肝臟中TG水平與血脂康216 mg/kg相當。結(jié)論:MP-A對NAFLD模型大鼠具有肝保護作用,且優(yōu)于血脂康,呈劑量依賴性。2 MP-A對高脂飲食誘導的NAFLD大鼠的腸道菌群結(jié)構的調(diào)控目的:考察MP-A對HFD誘導的NAFLD模型大鼠的腸道菌群影響。方法:采用HFD誘導方構建NAFLD模型大鼠。18只大鼠隨機分成3組:正常組、HFD組、MP-A(600 mg/kg)組,每組6只。除正常組外,其余大鼠均喂食高脂飼料。每周測量一次體重和攝食量。自第3周起,進行MP-A干預。正常組和HFD組灌胃相同體積的溶劑。第8周結(jié)束時,對各組大鼠進行麻醉采血,即可處死,然后采集肝臟、門靜脈血液和盲腸內(nèi)容物。測量肝重,并對其進行病理切片染色、觀察和評分;測量肝功能指標、血脂和肝內(nèi)TG水平;對盲腸內(nèi)容物進行宏基因組測序和多變量分析。結(jié)果:MP-A可顯著地減緩體重、肝重的增長速率,降低NAFLD模型大鼠的肝臟TG和血脂水平,且對大鼠的攝食量無明顯影響。同時,結(jié)合肝組織病理切片觀察和肝功能指標結(jié)果,進一步證實MP-A可減輕HFD引起的肝損傷。腸道菌群測序結(jié)果顯示,18個樣品中可獲得511,812條高質(zhì)量序列。根據(jù)97%相似度,將其歸類成6115個操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),進行了 α和β多樣性分析及物種注釋后的聚類分析。α和β多樣性分析結(jié)果表明,MP-A可以提高菌群的豐富程度和維持菌群的基本生態(tài)結(jié)構與分布。從門水平的聚類分析結(jié)果來看,MP-A可提高因HFD誘導而降低的擬桿菌門的豐度,抑制HFD引起的厚壁菌門和變形桿菌門豐度升高。從屬水平來看,共有63個菌屬因HFD豐度發(fā)生了顯著變化。經(jīng)過MP-A的干預后,其中的13個菌屬豐度可被顯著改善。結(jié)合實驗結(jié)果并經(jīng)文獻調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)MP-A可顯著提高Alloprevotella,Akkermansia,雙歧桿菌和Butyricimonas這四個益生菌豐度。MP-A還可顯著降低致病菌Turicibacter的豐度。結(jié)論:MP-A可通過重塑菌群的生態(tài)分布,提高菌群多樣性和部分益生菌的豐度,還可降低某些病原微生物的豐度,對高NAFLD模型大鼠的腸道菌群具有調(diào)節(jié)和保護作用。3 MP-A對“腸道菌群-腸-肝”軸相關信號通路的調(diào)節(jié)目的:考察MP-A對腸道菌群代謝產(chǎn)物及其相關“腸-肝”軸信號通路的影響。方法:使用氣相色譜法檢測盲腸內(nèi)容物中的SCFAs濃度;分別使用生化分析儀和鱟試劑對門靜脈血液中乙醇和LPS的濃度進行檢測;采用RT-PCR和Western blot實驗對肝臟中的TLR4、NF-κB p65、PPARγ、SREBP-1c進行核酸和蛋白水平的進行定量;采用ELISA實驗檢測肝內(nèi)的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。結(jié)果:MP-A可顯著地降低門靜脈中乙醇和LPS的水平,抑制肝內(nèi)TLR4和NF-κB p65表達及下游炎癥因子的分泌,緩解肝內(nèi)炎癥。同時,氣相色譜結(jié)果顯示,MP-A的干預還可促進腸道內(nèi)SCFAs的產(chǎn)生,轉(zhuǎn)運至肝臟后可抑制PPRγ和SREBP-1c表達和活性,調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂質(zhì)代謝,緩解HFD大鼠肝臟的脂肪變性。結(jié)論:MP-A可通過調(diào)節(jié)“LPS-TLR4-NF-κB”和SCFAs通路,改善和緩解HFD大鼠的NAFLD進程。
【圖文】：

圖１．１邋ＭＰ－Ａ的結(jié)構逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＭＰ－Ａ逡逑

．１．４．１藥物溶液的配制逡逑ＭＰ－Ａ邋（６００ｍｇ／ｋｇ）溶液：稱�。矗福纾停校�，加蒸餾水溶解至４０ｍＬ，濃度逡逑為１２０邋ｍｇ／ｍＬ。其他劑量組的溶液依次按比例稀釋得到。逡逑血脂康（２１６邋ｍｇ／ｋｇ）溶液：�。戳Ｑ涤谘欣徶羞M行研磨，，然后加蒸餾逡逑水混懸至２７．６邋ｍＬ，濃度為０．０４３邋ｇ／ｍＬ。逡逑１．４．２動物分組逡逑將３６只ＳＤ雄大鼠通過簡單隨機化分成６組：正常組、ＨＦＤ組、血脂康組、逡逑ＭＰ－Ａ邋（１００ｍｇ／ｋｇ）組、ＭＰ－Ａ邋（３００ｍｇ／ｋｇ）組、ＭＰ－Ａ邋（６００ｍｇ／ｋｇ）組，每組逡逑６只。逡逑１．４．３實驗過程逡逑Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2590237