本文關(guān)鍵詞：芥子氣脂肪蓄積新發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)效應(yīng)研究

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【摘要】：芥子氣(Sulfur Mustard, SM)是一種具有強(qiáng)烷基化能力的起皰劑,可快速透過(guò)皮膚、眼睛和肺支氣管粘膜等途徑進(jìn)入生物體內(nèi)與多種生命物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。由于其制備簡(jiǎn)單、殺傷力大,在戰(zhàn)爭(zhēng)中被廣泛使用。當(dāng)前,日本二戰(zhàn)后遺棄在華的大量化學(xué)武器,其中以SM為主,仍在威脅中國(guó)人民的生命和財(cái)產(chǎn)安全。隨著近年來(lái)國(guó)際極端民族主義和宗教主義的死灰復(fù)燃,SM被用于恐怖襲擊和不對(duì)稱戰(zhàn)爭(zhēng)的可能性日益增大,因此繼續(xù)對(duì)SM損傷機(jī)理和防治手段的研究仍有重要的現(xiàn)實(shí)意義。自首次合成至今,對(duì)SM的毒理機(jī)制研究已持續(xù)了一個(gè)多世紀(jì),科學(xué)家對(duì)SM損傷機(jī)制提出了很多假說(shuō),但其明確機(jī)理仍然未知。由于芥子氣具有親脂性,暴露后會(huì)迅速透過(guò)機(jī)體表面屏障,侵入機(jī)體組織和循環(huán)系統(tǒng),可與DNA、蛋白質(zhì)等絕大多數(shù)生物分子發(fā)生廣泛烷基化反應(yīng)。這些分子的烷基化會(huì)影響DNA的合成與修復(fù),干擾酶活和細(xì)胞代謝,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)和代謝紊亂的發(fā)生。同時(shí)SM損傷存在潛伏期,其癥狀在暴露數(shù)小時(shí)后才會(huì)出現(xiàn),且癥狀反復(fù)多樣,目前尚無(wú)SM損傷的特效治療方案。因此SM仍是一種難防難治的化學(xué)戰(zhàn)劑。本課題組前期研究建立的SM原型的衍生化液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法,針對(duì)SM原型在大鼠組織中的分布進(jìn)行研究,結(jié)果提示脂肪組織中SM原型存在高水平持續(xù)留存,發(fā)現(xiàn)了SM脂肪蓄積的新現(xiàn)象并進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)通過(guò)SM-DNA加合物同時(shí)定量檢測(cè)方法的建立,本課題組對(duì)SM-DNA加合物在大鼠組織中的分布進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)脂肪含量高的組織中,如骨髓和腦,其SM-DNA加合物含量也較高,且SM-DNA加合物在脂肪組織中可較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在,提示親脂環(huán)境對(duì)加合物形成可能具有顯著影響。基于實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果,本論文通過(guò)體外染毒后脂肪細(xì)胞在DNA加合物形成、存活率和細(xì)胞損傷評(píng)價(jià),以及大鼠染毒后脂肪組織脂體系數(shù)、病理?yè)p傷評(píng)價(jià),對(duì)SM脂肪蓄積的毒性效應(yīng)進(jìn)行了研究；通過(guò)染毒后大鼠脂源因子mRNA水平和蛋白水平評(píng)價(jià),初步探討了SM脂肪蓄積的生物學(xué)意義。全文共分為五章。第一章是前言。該部分對(duì)SM在理化性質(zhì)、歷史、損傷機(jī)制方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹,并對(duì)近年來(lái)脂肪組織功能和脂源因子研究的成果進(jìn)行了評(píng)述。提出了本論文的研究目的、研究?jī)?nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)。第二章是體外染毒模型的建立。通過(guò)分離大鼠原代前脂肪細(xì)胞,對(duì)脂肪細(xì)胞分化條件進(jìn)行了優(yōu)化；通過(guò)培養(yǎng)人皮下前脂肪細(xì)胞(Human Preadipocytes subcultaneous,HPA-s),成功獲得高分化率(80%)的成熟脂肪細(xì)胞(Human Adipocytes subcultaneous,HA-s);并成功培養(yǎng)傳代三種SM主要損傷組織的人源化細(xì)胞包括人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)、人肺纖維細(xì)胞(HLF)、正常人類肝細(xì)胞(L-02),作為對(duì)照細(xì)胞,為SM脂肪蓄積研究體外染毒實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞模型。同時(shí)通過(guò)CCK-8方法檢測(cè)包括成熟脂肪細(xì)胞在內(nèi)五種細(xì)胞的SM染毒IC50,結(jié)果顯示HA-s細(xì)胞的SM染毒IC50(484.3±22.7μM)遠(yuǎn)高于其它四種細(xì)胞(HaCaT 77.5±5.5 μM、HLF 69.9±4.3 μM、L-02 73.8±3.7 μM、HPA-s 62.5± 0.4 μM),初步說(shuō)明脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒具有抵抗能力。第三章是體外染毒SM-DNA加合物檢測(cè)。基于已建立的UPLC-MS/MS方法,我們進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明該方法對(duì)從體外染毒細(xì)胞中提取SM-DNA加合物的檢測(cè),具有較好的選擇性、檢測(cè)線性、準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性,其定量限低(N7-HETEG為0.02 ng/mL、Bis-G為0.05 ng/mL.N3-HETEA為0.1 ng/mL),基質(zhì)效應(yīng)小,回收率高,樣品穩(wěn)定性也較好。各項(xiàng)參數(shù)均符合驗(yàn)證要求。確定其可被用于體外染毒細(xì)胞SM-DNA加合物的同時(shí)定量檢測(cè)。通過(guò)對(duì)包括成熟脂肪細(xì)胞在內(nèi)的五種細(xì)胞進(jìn)行體外染毒SM-DNA加合物的量時(shí)關(guān)系進(jìn)行檢測(cè),對(duì)包括成熟脂肪細(xì)胞在內(nèi)的不同染毒細(xì)胞SM-DNA加合物形成差異進(jìn)行了研究。結(jié)果表明SM-DNA單取代加合物形成速度高于雙取代加合物,而三種加合物的相對(duì)含量依次為：N7-HETEGBis-GN3-HETEA;不同細(xì)胞SM-DNA加合物形成的峰值差異較小,但成熟脂肪細(xì)胞雙取代加合物占比更高(33%),在SM-DNA加合物達(dá)峰時(shí)間和清除速度上也低于其它組織來(lái)源細(xì)胞。從而在體外水平證實(shí)了SM脂肪蓄積現(xiàn)象和脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒的抵抗能力。第四章是SM體外染毒對(duì)細(xì)胞功能的影響。通過(guò)高內(nèi)涵分析,從細(xì)胞核和細(xì)胞形態(tài)、溶酶體、線粒體、氧化應(yīng)激和DNA損傷方面對(duì)HPA-s和HA-s在SM染毒后細(xì)胞損傷與染毒劑量和染毒時(shí)間的變化趨勢(shì)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示SM染毒造成了細(xì)胞損傷,其程度與染毒劑量和染毒時(shí)間成依賴關(guān)系；染毒HA-s在溶酶體、線粒體、氧化應(yīng)激和DNA損傷方面細(xì)胞毒性指標(biāo)隨染毒劑量和時(shí)間變化的速度和水平均低于HPA-s。從細(xì)胞毒性參數(shù)角度揭示了成熟脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒損傷抵抗能力。同時(shí)選擇HA-s和HLF染毒上清與HaCaT、HLF和L-02染毒細(xì)胞共培養(yǎng),通過(guò)CCK-8方法對(duì)染毒上清共培養(yǎng)細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè),研究HA-s和HLF染毒上清對(duì)其它細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明HLF細(xì)胞染毒上清會(huì)提高其它細(xì)胞體外染毒ICso值；而HA-s細(xì)胞染毒上清則會(huì)降低其它細(xì)胞體外染毒IC5o值,同時(shí)降低程度與HA-s的染毒劑量成依賴關(guān)系。提示了脂源因子對(duì)其它細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及脂肪蓄積SM的繼發(fā)毒性,以及清除脂肪細(xì)胞中的SM對(duì)降低機(jī)體繼發(fā)損傷的重要性。第五章是SM染毒對(duì)大鼠脂肪組織功能的影響。通過(guò)大鼠染毒模型,獲得染毒大鼠體重和脂體系數(shù)變化趨勢(shì)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示脂肪組織在機(jī)體染毒應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中被劇烈消耗,提示了脂肪中蓄積的SM隨組織劇烈消耗而再次釋放的可能。通過(guò)病理切片,評(píng)價(jià)了皮下、腎周、附睪和褐色脂肪組織的病理?yè)p傷情況。結(jié)果顯示脂肪組織暴露損傷主要體現(xiàn)為血管擴(kuò)張,和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),對(duì)成熟脂肪細(xì)胞的損傷則并不明顯。從體內(nèi)水平驗(yàn)證了成熟脂肪細(xì)胞對(duì)SM染毒的抵抗能力。通過(guò)RT-qPCR和定量ELISA,對(duì)大鼠皮下脂肪組織中各脂源因子水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示SM染毒會(huì)導(dǎo)致促炎因子上調(diào)、抑炎因子下調(diào),脂肪細(xì)胞分化因子和能量代謝因子的分泌也受到影響。而脂源因子在皮下脂肪和血清中的含量變化趨勢(shì)相同。一方面證明暴露后脂肪組織局部炎癥和機(jī)體系統(tǒng)炎癥的同步發(fā)生和發(fā)展；另一方面說(shuō)明脂肪組織在SM暴露后不但具有重要的能量供應(yīng)作用,更可發(fā)揮重要炎癥和代謝調(diào)節(jié)作用,揭示了SM脂肪蓄積的重要生物學(xué)意義。
【關(guān)鍵詞】：芥子氣 脂肪蓄積 脂肪細(xì)胞 加合物 中毒損傷
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R82
【目錄】：

• 縮略詞表6-10
• 摘要10-14
• Abstract14-18
• 1 前言18-32
• 1.1 芥子氣（SM）18-20
• 1.1.1 理化性質(zhì)18
• 1.1.2 難防難治的SM18-19
• 1.1.3 SM的研究歷史及新時(shí)期特點(diǎn)19-20
• 1.2 SM損傷機(jī)理20-22
• 1.2.1 SM與DNA損傷20
• 1.2.2 SM-DNA加合物的檢測(cè)20-22
• 1.3 SM脂肪蓄積現(xiàn)象22-28
• 1.3.1 脂肪組織功能25-26
• 1.3.2 脂源因子26-28
• 1.4 本論文研究目的、內(nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)28-32
• 1.4.1 研究目的及意義28
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容28-29
• 1.4.3 創(chuàng)新點(diǎn)29-32
• 2 體外染毒模型建立32-46
• 2.1 引言32
• 2.2 材料及儀器32-36
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器32
• 2.2.2 試劑材料32-33
• 2.2.3 溶液配制33-36
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法36-41
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)36-38
• 2.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定38
• 2.3.3 前脂肪細(xì)胞分化條件優(yōu)化及鑒定38-40
• 2.3.4 SM體外染毒IC50檢測(cè)40-41
• 2.4 結(jié)果與討論41-44
• 2.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線41-42
• 2.4.2 前脂肪細(xì)胞分化條件優(yōu)化及鑒定42-43
• 2.4.3 SM染毒IC50檢測(cè)43-44
• 2.5 小結(jié)44-46
• 3 體外染毒SM-DNA加合物檢測(cè)46-72
• 3.1 引言46
• 3.2 材料與儀器46-49
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器46-47
• 3.2.2 試劑材料47-48
• 3.2.3 溶液配制48-49
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法49-58
• 3.3.1 樣品前處理49-50
• 3.3.2 SM-DNA加合物UPLC-MS/MS檢測(cè)方法50-51
• 3.3.3 體外染毒SM-DNA加合物UPLC-MS/MS檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證51-55
• 3.3.4 SM染毒實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)55
• 3.3.5 體外染毒SM-DNA加合物與細(xì)胞濃度間的量效關(guān)系55-56
• 3.3.6 體外染毒SM-DNA加合物與SM染毒劑量間的量效關(guān)系56-57
• 3.3.7 體外染毒SM-DNA加合物與染毒劑中FBS含量間的量時(shí)關(guān)系 . 52 3.3.8 不同細(xì)胞體外染毒DNA加合物的量時(shí)關(guān)系57
• 3.3.8 不同細(xì)胞體外染毒 DNA 加合物的量時(shí)關(guān)系57-58
• 3.4 結(jié)果與討論58-70
• 3.4.1 UPLC-MS/MS方法學(xué)驗(yàn)證58-63
• 3.4.2 體外染毒SM-DNA加合物與細(xì)胞濃度間的量效關(guān)系63-64
• 3.4.3 體外染毒SM-DNA加合物與染毒劑量間的量效關(guān)系64-65
• 3.4.4 體外染毒SM-DNA加合物與染毒劑中FBS含量間的量效關(guān)系 . 60 3.4.5 不同細(xì)胞體外染毒DNA加合物的量時(shí)關(guān)系65-67
• 3.4.5 不同細(xì)胞體外染毒 DNA 加合物的量時(shí)關(guān)系67-70
• 3.5 小結(jié)70-72
• 4 SM體外染毒對(duì)細(xì)胞功能的影響72-92
• 4.1 引言72
• 4.2 材料與儀器72-76
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器72-73
• 4.2.2 試劑材料73
• 4.2.3 溶液配制73-76
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法76-80
• 4.3.1 SM染毒實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)76
• 4.3.2 成熟脂肪細(xì)胞體外染毒HCS分析76-78
• 4.3.3 不同細(xì)胞染毒上清共培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞染毒IC50的影響78-80
• 4.4 結(jié)果與討論80-91
• 4.4.1 體外染毒細(xì)胞毒性多參數(shù)分析80-89
• 4.4.2 不同細(xì)胞染毒上清共培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞染毒IC50的影響89-91
• 4.5 小結(jié)91-92
• 5 SM染毒對(duì)大鼠脂肪組織功能的影響92-114
• 5.1 引言92
• 5.2 材料與儀器92-94
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器92
• 5.2.2 試劑材料92-93
• 5.2.3 溶液配制93-94
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法94-102
• 5.3.1 SM染毒實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)94
• 5.3.2 大鼠皮膚染毒模型建立94-95
• 5.3.3 大鼠脂肪組織病理切片制備95
• 5.3.4 大鼠脂肪組織脂源因子mRNA水平檢測(cè)95-99
• 5.3.5 大鼠脂肪組織和血清中脂源因子蛋白水平檢測(cè)99-102
• 5.4 結(jié)果與討論102-112
• 5.4.1 大鼠脂體系數(shù)102-103
• 5.4.2 大鼠脂肪組織病理?yè)p傷103-105
• 5.4.3 大鼠脂肪組織脂源因子mRNA水平檢測(cè)105-110
• 5.4.4 大鼠脂肪組織和血清中脂源因子蛋白水平檢測(cè)110-112
• 5.5 小結(jié)112-114
• 結(jié)論114-116
• 參考文獻(xiàn)116-130
• 文獻(xiàn)綜述130-140
• 參考文獻(xiàn)137-140
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷140-141
• 致謝141-14

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：825003