本文關(guān)鍵詞：力學(xué)載荷與CKIP-1基因缺失對抗微重力下骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景骨質(zhì)疏松癥(OP,osteoporosis)主要是因?yàn)楣侵厮苓^程平衡被打破,骨形成與骨吸收過程中后者占主導(dǎo)地位,導(dǎo)致骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨折概率增大的一種嚴(yán)重危害患者生命健康的骨代謝疾病。大量研究表明,酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1,CKIP-1)在骨組織增殖、分化過程中起重要作用,其主要與泛素連接酶Smurf1相互作用進(jìn)而影響骨生長的過程;近年來,大量研究證明力學(xué)環(huán)境與骨組織生長狀況關(guān)系十分密切,力學(xué)載荷越來越受到大家的關(guān)注,尤其是在成骨效應(yīng)方面。研究目的通過尾吊飼養(yǎng)方法模擬失重環(huán)境,進(jìn)而建立失重性骨質(zhì)疏松的小鼠模型,研究小鼠脛骨軸向生理性載荷(2500με)與過載(5000με)以及CKIP-1基因敲除對骨質(zhì)疏松的對抗與治療作用;希望為臨床治療骨科相關(guān)疾病,尤其是太空環(huán)境下微重力導(dǎo)致的失重性骨疏松提供一種新的預(yù)防或治療方法,為長期在太空飛行的航天員預(yù)防保健提供專業(yè)的參考意見和理論基礎(chǔ)。研究方法1.骨質(zhì)疏松模型的建立:將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組,對照組(Normal)、尾吊組(TS),適應(yīng)性飼養(yǎng)1W后,對照組常規(guī)飼養(yǎng),尾吊組進(jìn)行鼠尾懸吊飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)周期為4W,試驗(yàn)結(jié)束后分別檢測兩組小鼠脛骨微觀參數(shù)、力學(xué)性能、血生化指標(biāo)等,觀察建模結(jié)果。2.不同強(qiáng)度周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷對微重力下骨質(zhì)疏松的作用:將2-3月齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組,對照組(Normal)、尾吊組(TS)、尾吊+生理性載荷組(Loading)、尾吊+過載組(Overloading),適應(yīng)性飼養(yǎng)1W后,對照組正常飼養(yǎng),其他各組尾吊飼養(yǎng)4周。尾吊期間,尾掉組小鼠不作其他處理,生理性載荷組小鼠后肢左側(cè)脛骨施加周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷(使其脛骨中段受到的峰值應(yīng)變約為2500με),過載組小鼠后肢左側(cè)脛骨施加力學(xué)載荷產(chǎn)生的微應(yīng)變約為5000με。加載時(shí)間為20 min,加載頻率為15 Hz,1次/3d。試驗(yàn)周期結(jié)束后,處死小鼠,斷頭取血,靜止10min后,3000r/min離心30min,取上層血清㧟80℃保存,以備后用。同時(shí),剝離出小鼠后肢離體脛骨,液氮中保存。采用小動(dòng)物活體計(jì)算機(jī)斷層掃描系統(tǒng)skyscan1076進(jìn)行microct掃描實(shí)驗(yàn)進(jìn)行骨小梁微觀結(jié)構(gòu)檢測;干骺端三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠脛骨骨組織宏觀力學(xué)性能;血清akp與bgp含量檢測成骨活性;實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測相關(guān)成骨基因表達(dá)情況。3.生理性載荷與ckip-1基因敲除對抗微重力下骨質(zhì)疏松的作用:將2-3月齡c57bl/6j小鼠隨機(jī)分為2組,尾吊組(ts)、尾吊+生理性載荷組(loading);同時(shí)將ckip-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為2組,尾吊組(記為ko)、尾吊+生理性載荷組(記為ko+loading),這樣得到共4組小鼠。適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后,對照組正常飼養(yǎng),其他各組尾吊飼養(yǎng)4周。尾吊期間,尾掉組小鼠不作其他處理,生理性載荷組小鼠后肢左側(cè)脛骨施加周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷(使其脛骨中段受到的峰值應(yīng)變約為2500με)。加載時(shí)間為20min,加載頻率為15hz,1次/3d。試驗(yàn)周期結(jié)束后,處死小鼠,斷頭取血,靜止10min后,3000r/min離心30min,取上層血清㧟80℃保存,以備后用。同時(shí),剝離出小鼠后肢離體脛骨,液氮中保存。采用小動(dòng)物活體計(jì)算機(jī)斷層掃描系統(tǒng)skyscan1076進(jìn)行microct掃描實(shí)驗(yàn)進(jìn)行骨小梁微觀結(jié)構(gòu)檢測;干骺端三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠脛骨骨組織宏觀力學(xué)性能;血清akp與bgp含量檢測成骨活性;實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測相關(guān)成骨基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)骨質(zhì)疏松模型評價(jià):小鼠尾吊4周后,與正常飼養(yǎng)小鼠相比,尾吊組小鼠骨組織大量流失,骨生物力學(xué)性能明顯降低,骨微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞、成骨活性顯著減弱,說明成功復(fù)制了骨質(zhì)疏松模型。(2)不同強(qiáng)度周期性力學(xué)載荷對微重力下骨質(zhì)疏松的影響:相比尾吊組,生理性載荷組改善了小鼠脛骨的宏觀力學(xué)性能(p0.05);過載組也可稍改善尾吊導(dǎo)致的力學(xué)性能下降,但作用不明顯(p0.05)。對小鼠后肢脛骨施加2500微應(yīng)變后,與尾吊組相比,生理性載荷組小鼠脛骨微觀結(jié)構(gòu)得到了顯著改善(p0.05),但與對照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異(p0.05);當(dāng)脛骨承受5000微應(yīng)變時(shí),該組骨小梁微觀結(jié)構(gòu)與尾掉組相比有改善的趨勢,但改變程度沒有顯著性差異(p0.05)。施加周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷可增強(qiáng)成骨活性,并抑制微重力致骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展。其中,生理性載荷作用顯著(p0.05),過載則作用不明顯(p0.05)。生理性載荷可以有效上調(diào)bmp-1、col-i、akp的表達(dá),增強(qiáng)成骨作用(p0.05);過載亦有上述作用,但結(jié)果沒有顯著性差異(p0.05)。(3)生理性載荷與CKIP-1基因?qū)ξ⒅亓ο鹿琴|(zhì)疏松的對抗與治療作用:干骺端三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)顯示,與尾吊組相比,生理性載荷和CKIP-1基因的缺失均能顯著改善由尾吊所致小鼠脛骨組織的力學(xué)性能降低的情況,主要表現(xiàn)在其斷裂應(yīng)變、斷裂能量的提高(P0.05),且二者聯(lián)合作用,改善效應(yīng)增強(qiáng)。小鼠脛骨微觀參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以有效抑制尾吊所致骨密度降低、骨組織大量流失等情況(P0.05)。血清AKP與BGP含量測定結(jié)果顯示,生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以提高與成骨活性相關(guān)的AKP與BGP含量,證明上述因素可以提高成骨活性(P0.05),促進(jìn)成骨。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,生理性載荷與CKIP-1基因敲除可以上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)(P0.05),抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)論研究通過尾吊飼養(yǎng)小鼠模擬微重力環(huán)境導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,盡管與真正意義上的太空微重力環(huán)境有一定的差距,并不能完全展示出微重力環(huán)境下骨質(zhì)疏松發(fā)生的過程,但是該模型作為一種較為成熟的模擬太空微重力環(huán)境的方法,其結(jié)果可以為太空長期作業(yè)人員提供一種可能的預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的方法。主要結(jié)論如下:(1)小鼠尾吊4周后,可成功復(fù)制失重性骨質(zhì)疏松模型;(2)生理性載荷與CKIP-1基因敲除均可有效抑制骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展,基因的調(diào)控效應(yīng)大于力學(xué)載荷調(diào)控作用,且二者共同作用效應(yīng)會(huì)加強(qiáng);(3)過載也可以改善微重力致骨質(zhì)疏松,但作用效果沒有顯著性差異。
【關(guān)鍵詞】：微重力環(huán)境 尾吊試驗(yàn) 失重性骨質(zhì)疏松 CKIP-1 力學(xué)載荷 對抗作用
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R85
【目錄】：

• 縮寫詞表6-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-15
• 第一章 前言15-20
• 1. 研究背景15-16
• 2. 研究目的與意義16-17
• 2.1 研究目的16
• 2.2 研究意義16-17
• 3. 研究內(nèi)容與方法17-19
• 3.1 研究內(nèi)容17
• 3.2 研究方案17-19
• 3.3 技術(shù)路線19
• 4. 實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法19-20
• 第二章 微重力環(huán)境的模擬與骨質(zhì)疏松模型的建立20-30
• 1. 背景介紹20
• 2.材料與方法20-25
• 2.1 材料與動(dòng)物20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)21
• 2.5 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容21-25
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• 3.1 CKIP-1 基因敲除小鼠分離結(jié)果25-26
• 3.2 麻醉實(shí)驗(yàn)結(jié)果26
• 3.3 小鼠體重變化結(jié)果26-27
• 3.4 干-骺端三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果27
• 3.5 骨微觀結(jié)構(gòu)掃描結(jié)果27-28
• 3.6 血清AKP與BGP含量測定結(jié)果28
• 4 討論28-29
• 5 本章小結(jié)29-30
• 第三章 不同強(qiáng)度周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷對骨質(zhì)疏松的影響30-38
• 1.背景介紹30
• 2. 材料與方法30-34
• 2.1 材料與動(dòng)物30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)31
• 2.5 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容31-34
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-36
• 3.1 微觀掃描骨小梁微觀參數(shù)檢測結(jié)果34-35
• 3.2 干-骺端三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果35
• 3.3 血清AKP與BGP含量測定結(jié)果35-36
• 3.4 qRT-PCR結(jié)果36
• 4.討論36-37
• 5.本章小結(jié)37-38
• 第四章 CKIP-1 基因與生理性周期性動(dòng)態(tài)力學(xué)載荷對抗骨質(zhì)疏松的研究38-51
• 1.背景介紹38
• 2.材料與方法38-43
• 2.1 材料與動(dòng)物38-39
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑39
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器39
• 2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)39-40
• 2.5 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容40-43
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-48
• 3.1 Micro-CT掃描骨小梁微觀參數(shù)檢測結(jié)果43-44
• 3.2 干-骺端三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-45
• 3.3 血清AKP與BGP含量測定結(jié)果45-46
• 3.4 qRT-PCR結(jié)果46-48
• 4.討論48-49
• 5.本章小結(jié)49-51
• 第五章 全文總結(jié)與展望51-53
• 全文總結(jié)51-52
• 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 個(gè)人簡歷58-59
• 致謝59

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本文編號：809435