本文關(guān)鍵詞：nNOS源性NO對(duì)心肌細(xì)胞L-型鈣通道的抑制性保護(hù)作用

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【摘要】：【背景】 近年來(lái)我國(guó)載人航天事業(yè)迅猛發(fā)展，航天員在軌時(shí)間逐步延長(zhǎng)。但是長(zhǎng)期暴露于失重環(huán)境下人體會(huì)出現(xiàn)立位耐力不良現(xiàn)象，這是由體液?jiǎn)适�、心肌收縮性能降低和血管發(fā)生適應(yīng)性重塑[1,2]三方面共同作用所導(dǎo)致。失重環(huán)境下體液?jiǎn)适滦呐K前負(fù)荷下降是導(dǎo)致心肌收縮性能降低的重要原因，而失重具體通過(guò)哪種機(jī)制引起心肌收縮性能下降，盡管研究很多，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)尾部懸吊大鼠心肌細(xì)胞神經(jīng)型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）表達(dá)下降伴有活性降低。大量研究表明nNOS主要定位于心肌細(xì)胞的肌質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜，并作用于受磷蛋白（phospholamban, PLB）、雷諾啶受體（ryanodine receptor, RyR）、L-型鈣通道（L-type calcium channel, LTCC）等等位點(diǎn)[3]，改變nNOS的表達(dá)量可以影響心肌的收縮與舒張功能[4]。LTCC作為興奮-收縮偶聯(lián)的關(guān)鍵步驟，我們推測(cè)失重條件下nNOS表達(dá)量的降低可能通過(guò)改變LTCC門控特性影響心肌收縮性能，因此本研究通過(guò)建立尾部懸吊大鼠模型，主要研究nNOS對(duì)LTCC門控特性的影響。 【目的】 (1)分離存活比例高、功能好和保存時(shí)間長(zhǎng)的心肌細(xì)胞。 (2)觀察4周模擬失重尾部懸吊大鼠（tail-suspended rats, SUS）及其同步對(duì)照（control,CON）組心肌nNOS表達(dá)量和活性變化，以及心肌LTCC(α1C)表達(dá)量的改變。 (3)在SUS組和CON組心肌細(xì)胞，觀察一氧化氮（nitric oxide, NO）對(duì)LTCC通道門控特性及其對(duì)異丙腎上腺素（isoproterenol, ISO）反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用。 【方法】 利用本科室已建立的尾部懸吊大鼠模型模擬失重條件下心臟變化，western blot方法檢測(cè)SUS組和CON組心肌nNOS和LTCC(α1C)表達(dá)量的差異，熒光法檢測(cè)nNOS活性變化。采用膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法全細(xì)胞模式檢測(cè)SUS組和CON組心肌LTCC通道門控特性的變化，包括激活特性、失活特性和恢復(fù)特性。 【結(jié)果】 (1)大容量細(xì)胞保存液可以長(zhǎng)時(shí)間維持心肌細(xì)胞功能 急性分離大鼠心肌細(xì)胞代謝旺盛，消耗保存液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致小容量保存液（20ml）pH值逐漸降低，異常形狀細(xì)胞比例增加，細(xì)胞線粒體膜電位絕對(duì)值降低，細(xì)胞自發(fā)熒光逐漸由線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）藍(lán)色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榧≡w維的綠色熒光，細(xì)胞I_(Ca.L)峰值幅度降低。大容量細(xì)胞保存液（100ml）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，緩沖能力強(qiáng)，可以長(zhǎng)時(shí)間維持液體pH于穩(wěn)定水平，進(jìn)而維持線粒體膜電位，保持細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于功能良好狀態(tài)。 (2)4周尾部懸吊大鼠心肌nNOS表達(dá)量與活性均降低；LTCC的α1C亞基表達(dá)量不變 Western blot方法檢測(cè)SUS組與CON組NOSs表達(dá)量的改變，結(jié)果顯示SUS組nNOS表達(dá)量顯著下降，而內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）表達(dá)量無(wú)顯著變化。使用一氧化氮熒光探針DAF-FM DA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與CON大鼠相比，4w SUS組總NOS活性降低，nNOS活性降低，NO產(chǎn)生量減少。SUS組與CON組心肌LTCC的α1C亞基表達(dá)量之間無(wú)顯著差別。 (3)在異丙腎上腺素（ISO）刺激條件下，nNOS源性NO對(duì)心肌細(xì)胞LTCC具有抑制性保護(hù)作用 與CON組相比，SUS組基礎(chǔ)狀態(tài)下LTCC電流-電壓曲線（I-V曲線）左移且峰值增大，通道半激活電壓（Va0.5）絕對(duì)值增加，激活斜率因子（ka）不變，提示通道容易激活；穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓與斜率因子不變，提示失活特性無(wú)差異；通道恢復(fù)時(shí)間常數(shù)（）縮短，提示恢復(fù)加速。在ISO刺激下，CON組I_(Ca.L)峰值增加，通道半激活電壓絕對(duì)值增加，激活斜率因子降低，提示通道激活加速；穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓（Vi0.5）與斜率因子（ki）未改變，提示失活特性未改變；恢復(fù)時(shí)間常數(shù)縮短，提示恢復(fù)加快，恢復(fù)百分比增加，提示恢復(fù)充分；然而，SUS組I_(Ca.L)峰值增加幅值顯著低于CON組；SUS組通道半激活電壓絕對(duì)值較CON組減小，激活斜率因子高于CON組，提示SUS組通道激活減慢；穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓絕對(duì)值高于CON組，斜率因子與CON組無(wú)差別，提示SUS組通道容易失活；恢復(fù)時(shí)間常數(shù)無(wú)差異，但是恢復(fù)百分比較CON組減小，提示通道恢復(fù)不充分，上述結(jié)果表明SUS組心肌細(xì)胞LTCC對(duì)ISO反應(yīng)性降低且通道門控特性受損。 nNOS特異性抑制劑灌流5min后，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，CON組I_(Ca.L)峰值增加；半激活電壓絕對(duì)值增加，激活斜率因子無(wú)變化，提示通道容易激活；穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓與斜率因子未改變，提示失活特性未改變；恢復(fù)時(shí)間常數(shù)縮短，提示恢復(fù)加速。nNOS特異性抑制劑和ISO聯(lián)合灌流5min，與單純ISO刺激相比，CON組I_(Ca.L)峰值降低；半激活電壓絕對(duì)值降低，激活斜率因子增加，提示通道激活減慢；穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓絕對(duì)值增加，斜率因子無(wú)差異，提示通道容易失活；恢復(fù)時(shí)間常數(shù)無(wú)差異，，但是恢復(fù)百分比降低，提示恢復(fù)不充分。上述結(jié)果表明CON組nNOS被抑制后，LTCC對(duì)ISO反應(yīng)性降低且通道門控特性受損。 NO供體SNAP（S-nitroso-N-acetylpenicillamine）灌流5min后，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，CON組I_(Ca.L)峰值無(wú)差異；半激活電壓絕對(duì)值增加，激活斜率因子降低，提示通道激活加速；穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓與斜率因子未改變，提示失活特性無(wú)差異；恢復(fù)時(shí)間常數(shù)縮短，提示恢復(fù)加速。SNAP和ISO聯(lián)合灌流5min后，與單純ISO刺激相比，CON組I_(Ca.L)峰值降低；半激活電壓絕對(duì)值降低，激活斜率因子增加，提示通道激活減慢；穩(wěn)態(tài)失活50%對(duì)應(yīng)脈沖電壓與斜率因子未改變，提示失活特性無(wú)差異；通道恢復(fù)時(shí)間常數(shù)和恢復(fù)百分比均無(wú)差異。上述結(jié)果表明NO過(guò)多可抑制通道開放，降低ISO刺激下I_(Ca.L)增加幅度，但不損傷通道門控特性。 【結(jié)論】 在功能與形態(tài)良好的心肌細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，采取降低與增加NO的方式，觀測(cè)心肌細(xì)胞LTCC對(duì)ISO的反應(yīng)性與通道特性，證明nNOS源性NO對(duì)心肌細(xì)胞LTCC具有抑制性保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)型一氧化氮合酶 L-型鈣通道 心肌細(xì)胞 心肌保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R852.22
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言與文獻(xiàn)回顧14-23
• 一、心肌細(xì)胞的分離與保存方法23-34
• 1.1 引言23-24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-26
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-31
• 1.4 討論31-34
• 二、影響 L-型鈣通道電流記錄的膜片鉗實(shí)驗(yàn)條件34-40
• 2.1 引言34
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-35
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-37
• 2.4 討論37-40
• 三、nNOS 源性 NO 對(duì)心肌細(xì)胞 L-型鈣通道的抑制性保護(hù)作用40-65
• 3.1 引言40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-46
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-60
• 3.4 討論60-65
• 小結(jié)65-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果73-74
• 致謝74

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張然,余志斌,王云英;成年小鼠心肌細(xì)胞分離技術(shù)[J];生理學(xué)報(bào);2004年05期

本文編號(hào)：807706