本文關(guān)鍵詞：miR-33-5p在小鼠失重性骨質(zhì)丟失中的作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 模擬失重 成骨細(xì)胞 細(xì)胞分化 miR-33-5p Hmga2

【摘要】：研究背景隨著我國(guó)航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展,中長(zhǎng)期載人航天活動(dòng)已經(jīng)進(jìn)入初步實(shí)施階段。長(zhǎng)時(shí)間處于失重環(huán)境對(duì)航天員造成的不良影響亟待我們深入研究并開(kāi)發(fā)有效的防護(hù)措施。長(zhǎng)時(shí)間暴露于失重環(huán)境會(huì)導(dǎo)致快速且嚴(yán)重的骨質(zhì)丟失,是目前限制人類進(jìn)行遠(yuǎn)距離航天飛行的主要醫(yī)學(xué)問(wèn)題。目前已采取了防護(hù)設(shè)備、體育鍛煉、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充以及物理治療等措施試圖解決失重性骨質(zhì)丟失這一問(wèn)題,但其效果均不理想。想要找到解決這一難題的有效辦法,充分研究其發(fā)生機(jī)制是一條必由之路。miRNA是一類可以對(duì)廣泛的生命活動(dòng)過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用的短鏈非編碼RNA,參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。近年來(lái)miRNA在各種疾病中的作用研究也愈趨成熟,它的研究也逐漸從單純機(jī)制探討向臨床應(yīng)用發(fā)展,如作為藥物干預(yù)的靶點(diǎn)、疾病早期診斷或病程判斷的標(biāo)志物。從骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、成熟到各種骨骼疾病的發(fā)生,均有研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)miRNAs參與到了其中。miRNA也調(diào)控著成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等骨組織中重要細(xì)胞的功能。但miRNA在失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用,目前還鮮有研究。已有研究發(fā)現(xiàn),失重環(huán)境下成骨細(xì)胞功能降低是導(dǎo)致失重性骨質(zhì)丟失的重要原因。近年來(lái),本課題組以成骨細(xì)胞為研究對(duì)象,依據(jù)失重所致成骨細(xì)胞功能下降過(guò)程中miRNA的變化特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)了在模擬失重環(huán)境下調(diào)控成骨細(xì)胞功能的多種miRNAs,并陸續(xù)研究了其作用機(jī)制,本項(xiàng)研究也是該項(xiàng)工作的一部分。目的本課題旨在從前期研究關(guān)注的候選miRNAs中選出在成骨細(xì)胞模擬失重環(huán)境下顯著差異表達(dá)的miRNA;明確其對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制;最后以該miRNA為干預(yù)靶點(diǎn),對(duì)小鼠尾吊模擬失重模型中骨質(zhì)丟失實(shí)施干預(yù)研究。方法1.采用SYBR Green法q RT-PCR與Taq Man探針?lè)◤暮蜻xmiRNAs中選出回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下成骨細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)顯著的miRNA,并研究其表達(dá)的時(shí)程變化。2.使用miR-33-5p的mimic和inhibitor在成骨細(xì)胞中進(jìn)行獲得性和缺失性功能研究:以成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物Runx2、Osx和ALP作為成骨細(xì)胞分化指標(biāo),q RT-PCR檢測(cè)其m RNA表達(dá),Western Blot檢測(cè)Runx2與Osx蛋白表達(dá),ALP活性與ALP染色檢測(cè)ALP的蛋白功能;CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖能力,另以PCNA作為增殖的標(biāo)志物,采用PCNA蛋白含量檢測(cè)平行驗(yàn)證CCK-8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;茜素紅染色及其半定量分析檢測(cè)成骨細(xì)胞的礦化功能;過(guò)表達(dá)成骨細(xì)胞中miR-33-5p,檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-33-5p是否可對(duì)抗模擬失重對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用。3.以熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-33-5p與預(yù)測(cè)所得靶基因Hmga2的直接結(jié)合關(guān)系,并以q RT-PCR、Western blot與免疫熒光染色檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低miR-33-5p對(duì)Hmga2的影響,并進(jìn)一步研究Hmga2在回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下的變化特點(diǎn)。通過(guò)過(guò)表達(dá)質(zhì)�；騭i RNA在成骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲低Hmga2,從而研究其對(duì)成骨細(xì)胞分化功能的影響。進(jìn)而通過(guò)miR-33-5p與Hmga2的調(diào)節(jié)因子共轉(zhuǎn)染的方式,驗(yàn)證miR-33-5p是否通過(guò)Hmga2影響成骨細(xì)胞分化。4.使用(AspSerSer)6-liposome成骨靶向遞送系統(tǒng)包裹miR-33-5p的類似物agomir-33,在體內(nèi)特異性地提高骨形成區(qū)成骨細(xì)胞中miR-33-5p的表達(dá)。使用micro CT、生物力學(xué)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)、鈣黃綠素雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)、馬松染色以及骨組織成骨細(xì)胞分化指標(biāo)檢測(cè)的方法,從多角度觀察靶向補(bǔ)充成骨細(xì)胞中miR-33-5p對(duì)尾吊模擬小鼠失重性骨質(zhì)丟失的防護(hù)作用。結(jié)果1.在回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下,成骨細(xì)胞中miR-33-5p的表達(dá)顯著下降,且隨失重時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)下降程度增大。2.miR-33-5p上調(diào)成骨細(xì)胞Runx2、Osx與ALP的表達(dá),且miR-33-5p在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)增加;補(bǔ)充miR-33-5p部分逆轉(zhuǎn)了回轉(zhuǎn)模擬失重所致的成骨細(xì)胞Runx2、Osx與ALP表達(dá)降低;miR-33-5p促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生;miR-33-5p不影響成骨細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)與CCK-8法檢測(cè)的細(xì)胞增殖活性。3.miR-33-5p可與Hmga2的3’UTR區(qū)直接結(jié)合;miR-33-5p不影響Hmga2 m RNA表達(dá)而抑制其蛋白表達(dá);回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下Hmga2的表達(dá)升高;Hmga2下調(diào)成骨細(xì)胞Runx2、Osx與ALP的表達(dá),且Hmga2在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)下降;干預(yù)Hmga2的表達(dá)可以削弱miR-33-5p對(duì)成骨細(xì)胞Runx2、Osx與ALP表達(dá)的調(diào)控作用。4.在體靶向提高成骨細(xì)胞miR-33-5p的表達(dá)可以部分緩解尾吊小鼠股骨成骨細(xì)胞功能的下降、新生骨質(zhì)的減少、骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞與股骨抗彎曲載荷能力的降低。結(jié)論1.模擬失重環(huán)境下成骨細(xì)胞miR-33-5p的表達(dá)顯著下降。2.miR-33-5p促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與礦化,對(duì)增殖無(wú)顯著影響。在成骨細(xì)胞中補(bǔ)充miR-33-5p可以部分恢復(fù)回轉(zhuǎn)模擬失重所致的成骨細(xì)胞分化抑制。3.Hmga2是miR-33-5p的靶基因,且miR-33-5p在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)。Hmga2抑制成骨細(xì)胞分化,且在模擬失重環(huán)境下表達(dá)升高。miR-33-5p對(duì)成骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用是部分通過(guò)Hmga2完成的。4.在體靶向提高成骨細(xì)胞miR-33-5p表達(dá)可以部分減緩尾吊小鼠股骨的骨質(zhì)丟失。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)模擬失重通過(guò)降低miR-33-5p從而抑制成骨細(xì)胞的分化與礦化,其機(jī)制是模擬失重減弱了miR-33-5p對(duì)抑分化因子Hmga2的抑制作用,且在體靶向提高成骨細(xì)胞miR-33-5p表達(dá)水平可以部分減緩尾吊小鼠股骨的骨質(zhì)丟失。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了失重性骨質(zhì)丟失的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,也為開(kāi)發(fā)新型失重性骨質(zhì)丟失防護(hù)措施提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：模擬失重 成骨細(xì)胞 細(xì)胞分化 miR-33-5p Hmga2
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R852.22
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-31
• 第一部分 模擬失重環(huán)境下MC3T3-E1前成骨細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA的篩選31-41
• 1 材料31-33
• 2 方法33-37
• 3 結(jié)果37-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 miR335p對(duì)MC3T3-E1前成骨細(xì)胞的調(diào)控作用41-56
• 1 材料41-43
• 2 方法43-46
• 3 結(jié)果46-53
• 4 討論53-56
• 第三部分 miR335p調(diào)控MC3T3-E1前成骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究56-74
• 1 材料56-58
• 2 方法58-61
• 3 結(jié)果61-72
• 4 討論72-74
• 第四部分 靶向補(bǔ)充成骨細(xì)胞中miR335p對(duì)尾吊小鼠骨質(zhì)丟失的防護(hù)作用74-89
• 1 材料75-76
• 2 方法76-79
• 3 結(jié)果79-87
• 4 討論87-89
• 小結(jié)89-90
• 參考文獻(xiàn)90-100
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果100-102
• 致謝102-103

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王瀚;miR-33-5p在小鼠失重性骨質(zhì)丟失中的作用及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：804341