本文關(guān)鍵詞：miR-33-5p在小鼠失重性骨質(zhì)丟失中的作用及其機制研究

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【摘要】：研究背景隨著我國航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展,中長期載人航天活動已經(jīng)進入初步實施階段。長時間處于失重環(huán)境對航天員造成的不良影響亟待我們深入研究并開發(fā)有效的防護措施。長時間暴露于失重環(huán)境會導致快速且嚴重的骨質(zhì)丟失,是目前限制人類進行遠距離航天飛行的主要醫(yī)學問題。目前已采取了防護設(shè)備、體育鍛煉、營養(yǎng)補充以及物理治療等措施試圖解決失重性骨質(zhì)丟失這一問題,但其效果均不理想。想要找到解決這一難題的有效辦法,充分研究其發(fā)生機制是一條必由之路。miRNA是一類可以對廣泛的生命活動過程發(fā)揮調(diào)控作用的短鏈非編碼RNA,參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。近年來miRNA在各種疾病中的作用研究也愈趨成熟,它的研究也逐漸從單純機制探討向臨床應用發(fā)展,如作為藥物干預的靶點、疾病早期診斷或病程判斷的標志物。從骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、成熟到各種骨骼疾病的發(fā)生,均有研究發(fā)現(xiàn)了多個miRNAs參與到了其中。miRNA也調(diào)控著成骨細胞、破骨細胞等骨組織中重要細胞的功能。但miRNA在失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生發(fā)展過程中的作用,目前還鮮有研究。已有研究發(fā)現(xiàn),失重環(huán)境下成骨細胞功能降低是導致失重性骨質(zhì)丟失的重要原因。近年來,本課題組以成骨細胞為研究對象,依據(jù)失重所致成骨細胞功能下降過程中miRNA的變化特點,發(fā)現(xiàn)了在模擬失重環(huán)境下調(diào)控成骨細胞功能的多種miRNAs,并陸續(xù)研究了其作用機制,本項研究也是該項工作的一部分。目的本課題旨在從前期研究關(guān)注的候選miRNAs中選出在成骨細胞模擬失重環(huán)境下顯著差異表達的miRNA;明確其對成骨細胞功能的影響,并進一步探討其作用機制;最后以該miRNA為干預靶點,對小鼠尾吊模擬失重模型中骨質(zhì)丟失實施干預研究。方法1.采用SYBR Green法q RT-PCR與Taq Man探針法從候選miRNAs中選出回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下成骨細胞內(nèi)差異表達顯著的miRNA,并研究其表達的時程變化。2.使用miR-33-5p的mimic和inhibitor在成骨細胞中進行獲得性和缺失性功能研究:以成骨細胞分化標志物Runx2、Osx和ALP作為成骨細胞分化指標,q RT-PCR檢測其m RNA表達,Western Blot檢測Runx2與Osx蛋白表達,ALP活性與ALP染色檢測ALP的蛋白功能;CCK-8法檢測成骨細胞的增殖能力,另以PCNA作為增殖的標志物,采用PCNA蛋白含量檢測平行驗證CCK-8的實驗結(jié)果;茜素紅染色及其半定量分析檢測成骨細胞的礦化功能;過表達成骨細胞中miR-33-5p,檢測過表達miR-33-5p是否可對抗模擬失重對成骨細胞分化的抑制作用。3.以熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-33-5p與預測所得靶基因Hmga2的直接結(jié)合關(guān)系,并以q RT-PCR、Western blot與免疫熒光染色檢測過表達或敲低miR-33-5p對Hmga2的影響,并進一步研究Hmga2在回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下的變化特點。通過過表達質(zhì)�；騭i RNA在成骨細胞中過表達或敲低Hmga2,從而研究其對成骨細胞分化功能的影響。進而通過miR-33-5p與Hmga2的調(diào)節(jié)因子共轉(zhuǎn)染的方式,驗證miR-33-5p是否通過Hmga2影響成骨細胞分化。4.使用(AspSerSer)6-liposome成骨靶向遞送系統(tǒng)包裹miR-33-5p的類似物agomir-33,在體內(nèi)特異性地提高骨形成區(qū)成骨細胞中miR-33-5p的表達。使用micro CT、生物力學三點彎曲試驗、鈣黃綠素雙標實驗、馬松染色以及骨組織成骨細胞分化指標檢測的方法,從多角度觀察靶向補充成骨細胞中miR-33-5p對尾吊模擬小鼠失重性骨質(zhì)丟失的防護作用。結(jié)果1.在回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下,成骨細胞中miR-33-5p的表達顯著下降,且隨失重時間延長表達下降程度增大。2.miR-33-5p上調(diào)成骨細胞Runx2、Osx與ALP的表達,且miR-33-5p在成骨細胞分化過程中表達增加;補充miR-33-5p部分逆轉(zhuǎn)了回轉(zhuǎn)模擬失重所致的成骨細胞Runx2、Osx與ALP表達降低;miR-33-5p促進成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的產(chǎn)生;miR-33-5p不影響成骨細胞PCNA蛋白表達與CCK-8法檢測的細胞增殖活性。3.miR-33-5p可與Hmga2的3’UTR區(qū)直接結(jié)合;miR-33-5p不影響Hmga2 m RNA表達而抑制其蛋白表達;回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境下Hmga2的表達升高;Hmga2下調(diào)成骨細胞Runx2、Osx與ALP的表達,且Hmga2在成骨細胞分化過程中表達下降;干預Hmga2的表達可以削弱miR-33-5p對成骨細胞Runx2、Osx與ALP表達的調(diào)控作用。4.在體靶向提高成骨細胞miR-33-5p的表達可以部分緩解尾吊小鼠股骨成骨細胞功能的下降、新生骨質(zhì)的減少、骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞與股骨抗彎曲載荷能力的降低。結(jié)論1.模擬失重環(huán)境下成骨細胞miR-33-5p的表達顯著下降。2.miR-33-5p促進成骨細胞分化與礦化,對增殖無顯著影響。在成骨細胞中補充miR-33-5p可以部分恢復回轉(zhuǎn)模擬失重所致的成骨細胞分化抑制。3.Hmga2是miR-33-5p的靶基因,且miR-33-5p在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達。Hmga2抑制成骨細胞分化,且在模擬失重環(huán)境下表達升高。miR-33-5p對成骨細胞分化的調(diào)控作用是部分通過Hmga2完成的。4.在體靶向提高成骨細胞miR-33-5p表達可以部分減緩尾吊小鼠股骨的骨質(zhì)丟失。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)模擬失重通過降低miR-33-5p從而抑制成骨細胞的分化與礦化,其機制是模擬失重減弱了miR-33-5p對抑分化因子Hmga2的抑制作用,且在體靶向提高成骨細胞miR-33-5p表達水平可以部分減緩尾吊小鼠股骨的骨質(zhì)丟失。我們的研究結(jié)果進一步闡明了失重性骨質(zhì)丟失的細胞學機制,也為開發(fā)新型失重性骨質(zhì)丟失防護措施提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：模擬失重 成骨細胞 細胞分化 miR-33-5p Hmga2
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R852.22
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-31
• 第一部分 模擬失重環(huán)境下MC3T3-E1前成骨細胞中差異表達miRNA的篩選31-41
• 1 材料31-33
• 2 方法33-37
• 3 結(jié)果37-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 miR335p對MC3T3-E1前成骨細胞的調(diào)控作用41-56
• 1 材料41-43
• 2 方法43-46
• 3 結(jié)果46-53
• 4 討論53-56
• 第三部分 miR335p調(diào)控MC3T3-E1前成骨細胞分化的機制研究56-74
• 1 材料56-58
• 2 方法58-61
• 3 結(jié)果61-72
• 4 討論72-74
• 第四部分 靶向補充成骨細胞中miR335p對尾吊小鼠骨質(zhì)丟失的防護作用74-89
• 1 材料75-76
• 2 方法76-79
• 3 結(jié)果79-87
• 4 討論87-89
• 小結(jié)89-90
• 參考文獻90-100
• 個人簡歷和研究成果100-102
• 致謝102-103

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王瀚;miR-33-5p在小鼠失重性骨質(zhì)丟失中的作用及其機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2016年

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本文編號：804341