本文關(guān)鍵詞：Hedgehog信號(hào)通路在海水吸入大鼠急性肺損傷中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】： 背景和目的: 海水淹溺不僅是航海事故、海上生產(chǎn)作業(yè)、旅游的死亡原因之一,而且是軍隊(duì)海上訓(xùn)練、作戰(zhàn)、搶灘登陸戰(zhàn)斗和非戰(zhàn)斗減員的重要原因。海水淹溺后絕大部分病人都有肺損傷并繼發(fā)肺水腫甚至海水型急性肺損傷(SW-ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(SW-RDS),使病情更加危重,救治極為困難。海水淹溺后高度肺水腫的形成與肺泡毛細(xì)血管膜的損傷密切相關(guān),作為肺泡毛細(xì)血管膜的內(nèi)屏障,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC)的增殖與修復(fù)將有利于降低肺泡毛細(xì)血管膜的通透性,從而減輕肺水腫程度。因此研究肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后修復(fù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,為防治海水淹溺ALI提供了新的思路。 Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是與胚胎形成及形態(tài)發(fā)生有關(guān)的信號(hào)途徑。主要由胞外的Hedgehog蛋白、細(xì)胞膜表面的特異性受體Patched (Ptc)及相關(guān)蛋白Smoothened (Smo)、胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Ci/Gli組成。Hedgehog蛋白是一種分泌型蛋白,在哺乳動(dòng)物中包括Shh(Sonic hedgehog)、Ihh(Indian hedgehog)和Dhh(Desert hedgehog)三種家族成員。近年發(fā)現(xiàn),Hh家族蛋白在許多成熟組織也有表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和自我更新,參與組織的損傷修復(fù),并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究表明,Hedgehog (Hh)信號(hào)通路的激活可促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)微血管重建。在此基礎(chǔ)上,我們推測(cè)海水吸入ALI時(shí),通過激活Hh信號(hào)通路,可促進(jìn)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,有利于肺泡毛細(xì)血管膜損傷后修復(fù),從而減輕肺水腫程度。為此,本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞細(xì)胞水平檢測(cè)Hh信號(hào)通路激活后對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響,從動(dòng)物水平檢測(cè)Hh信號(hào)通路激活后對(duì)肺微血管通透性和肺水腫程度的影響,為海水淹溺ALI的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.采用外周肺組織貼塊法培養(yǎng)大鼠PMVEC,抽取組織塊進(jìn)行切片觀察,以大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)照,對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,通過光鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。 2.將大鼠PMVEC隨機(jī)分為正常對(duì)照組和海水處理2h、4h、8h和16h組。RT-PCR法分別檢測(cè)細(xì)胞中Shh、Ptc-1和Gli1 mRNA表達(dá)情況;Western blotting法分別檢測(cè)細(xì)胞中Shh、Ptch1和Gli1蛋白表達(dá)情況;光鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化。 3.將大鼠PMVEC隨機(jī)分為正常對(duì)照組和Shh50 ng/ml組、Shh100 ng/ml組、Shh200 ng/ml組、Shh400 ng/ml組和cyclopamine+Shh100 ng/ml組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性。 4.大鼠PMVEC隨機(jī)分為正常對(duì)照組、海水組、Shh50 ng/ml +海水組、Shh100 ng/ml +海水組、Shh200 ng/ml +海水組、Shh400 ng/ml +海水組和cyclopamine+Shh100 ng/ml+海水組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性,TUNNL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。5.采用屏氣后經(jīng)氣管吸入4ml/Kg海水復(fù)制大鼠海水吸入ALI模型,隨機(jī)分為對(duì)照組和海水組,每組又分為1h、2h、4h和8h四個(gè)時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)和肺組織濕干重比(W/D),肺微血管通透性、肺組織MPO活性和MDA含量、血清和BALF中TNF-α和IL-1β含量、RT-PCR法和Western Blot法分別檢測(cè)肺組織Shh、Ptc-1和Gli1mRNA和蛋白表達(dá)水平,并進(jìn)行肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察。 6.采用海水吸入ALI大鼠模型,靜脈注射人重組Shh因子6mg/kg干預(yù)后,檢測(cè)大鼠PaO2、肺W/D、肺微血管通透性、Ptc-1和Gli1mRNA和蛋白表達(dá)變化,并進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果: 1.組織塊法培養(yǎng)大鼠PMVEC的綜合鑒定結(jié)果顯示:組織塊源于外周肺組織,Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34免疫熒光化學(xué)染色陽性,植物凝集素BSI結(jié)合試驗(yàn)陽性,透射電鏡細(xì)胞表面有較多突起,胞漿中有較多吞飲小泡。 2.與正常對(duì)照組比較,從4h開始,海水組細(xì)胞Shh、Ptc-1和Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)量減少,8h最低,16h有所增加。光鏡下可見海水處理16h后,PMVEC細(xì)胞皺縮,胞質(zhì)減少,細(xì)胞間距增大,部分細(xì)胞脫落。電鏡下可見海水處理16h大鼠PMVEC細(xì)胞表面突起減少,胞漿濃縮,線粒體水腫,嵴消失,胞漿中吞飲小泡增多,核內(nèi)異染色質(zhì)增多。 3. Shh處理正常大鼠PMVEC細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng),并呈劑量依賴性。Cyclopamine+Shh100ng/ml組細(xì)胞增殖活性明顯低于對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)Shh100ng/ml組。 4.與正常對(duì)照組相比,海水組PMVEC細(xì)胞增殖明顯減少,而Shh處理各組細(xì)胞增殖活性明顯高于海水組;Cyclopamine組細(xì)胞增殖活性明顯低于Shh處理組。海水處理PMVEC 8h后,細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯增加,而Shh處理各組細(xì)胞凋亡明顯低于海水組,Cyclopamine組細(xì)胞凋亡明顯高于Shh處理組。 5.大鼠經(jīng)氣管吸入海水后,其PaO2明顯低于對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組,氧合指數(shù)300;肺W/D、肺微血管通透性、肺組織MPO活性和MDA含量、血清和BALF中TNF-α和IL-1β含量明顯高于對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組,并隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加;肺組織Shh、Ptc-1和Gli1mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組,并隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。 6.海水吸入ALI大鼠注射人重組Shh因子后,其PaO2明顯高于海水組,肺W/D和肺微血管通透性明顯低于海水組,Ptc-1和Gli1mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于海水組。 結(jié)論: 1.海水刺激下大鼠PMVEC增殖受抑制,細(xì)胞凋亡增多。 2.人重組Shh可通過激活Hedgehog信號(hào)通路,促進(jìn)正常大鼠PMVEC增殖并抑制其凋亡。 3.Hedgehog信號(hào)分子在海水處理大鼠PMVEC中表達(dá)降低,采用人重組Shh激活Hedgehog信號(hào)通路可促進(jìn)海水處理大鼠PMVEC細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。 4.成功建立海水吸入ALI大鼠模型。海水吸入ALI大鼠肺組織中肺微血管通透性和肺水腫程度隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行性增加;Hedgehog信號(hào)分子在海水吸入ALI大鼠肺組織中表達(dá)降低,采用人重組Shh激活Hedgehog信號(hào)通路后,可降低海水吸入ALI大鼠肺微血管通透性,減輕肺水腫程度。這種效應(yīng)可能是Hedgehog信號(hào)通路激活后通過對(duì)PMVEC的保護(hù)作用實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：海水 急性肺損傷 肺水腫 肺微血管通透性 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 Hedgehog信號(hào)通路 Shh Patched-1 Gli1
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R83
【目錄】：

• 英文縮寫索引6-8
• 英文摘要8-12
• 中文摘要12-15
• 論文正文 Hedgehog 信號(hào)通路在海水吸入大鼠急性肺損傷中的作用及其機(jī)制研究15-102
• 前言15-17
• 第一部分 Hedgehog 信號(hào)分子在海水浸泡大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)變化17-40
• 分題一 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定17-23
• 材料與方法17-22
• 結(jié)果22-23
• 分題二 Hedgehog 信號(hào)分子在海水刺激RPMVEC 中的表達(dá)變化23-40
• 材料與方法23-34
• 結(jié)果34-36
• 討論36-40
• 第二部分 Hedgehog 信號(hào)通路對(duì)海水處理大鼠PMVEC 的細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究.40-48
• 材料與方法40-42
• 結(jié)果42-44
• 討論44-48
• 第三部分 Hedgehog 信號(hào)通路對(duì)海水吸入急性肺損傷大鼠肺微血管通透性影響的研究..48-85
• 分題一 海水吸入急性肺損傷大鼠Hedgehog 信號(hào)分子的表達(dá)變化48-72
• 材料與方法48-63
• 結(jié)果63-72
• 分題二 重組Shh 因子對(duì)海水吸入急性肺損傷大鼠肺微血管通透性影響的研究72-85
• 材料與方法72-76
• 結(jié)果76-82
• 討論82-85
• 全文結(jié)論85-86
• 致謝86-87
• 照片87-96
• 參考文獻(xiàn)96-102
• 文獻(xiàn)綜述 Hedgehog 信號(hào)系統(tǒng)在血管生成中的作用102-110
• 參考文獻(xiàn)106-110
• 在讀期間發(fā)表的文章110-111
• 英文論著111-124

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號(hào)：731657