本文關(guān)鍵詞：太空環(huán)境對(duì)鏈球菌菌體多糖分子表達(dá)的影響

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【摘要】： 研究背景 眾所周知,浩瀚的太空疆域無垠,有著地面上難以比擬的環(huán)境條件。目前研究證實(shí)太空環(huán)境具有強(qiáng)輻射、高真空、微重力、高潔凈等特點(diǎn),存在著誘發(fā)生物體突變的多種因素。早在20世紀(jì)60年代,美國、蘇聯(lián)等科學(xué)家就進(jìn)行了太空環(huán)境對(duì)病毒、細(xì)菌、植物染色體等研究,發(fā)現(xiàn)空間環(huán)境輻射可導(dǎo)致多種生物體DNA鏈斷裂、細(xì)胞分化異常及致突變率較高等特點(diǎn)。其后世界各航天強(qiáng)國陸續(xù)進(jìn)行太空環(huán)境對(duì)其他有生命物質(zhì)影響的探索,在宏觀層面多為誘變物的性狀、功能方面的研究,而微觀方面也大多是蛋白質(zhì)及基因方面的研究。他們證實(shí)了太空環(huán)境除具改變生物體性狀及功能的作用外,還可以誘導(dǎo)基因的突變及影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。復(fù)合糖在生物的分化、繁殖、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫機(jī)制等方面具有重要的生物功能。然而,至今太空環(huán)境對(duì)多糖分子表達(dá)影響方面的研究尚少。太空環(huán)境作為一個(gè)全新的區(qū)域,已成為世界各國空間科學(xué)研究的熱點(diǎn),其在能源、制藥等多方面發(fā)揮著重要作用。有關(guān)資料表明,若到太空環(huán)境中制藥一個(gè)月的產(chǎn)量可相當(dāng)于地球上30-60年的產(chǎn)量。我國就有幾種藥品是通過衛(wèi)星載入太空后取得的,具有非常好效果。由此可見,利用太空環(huán)境的誘變效應(yīng)用來制藥將有著非常廣闊的前景。多糖分子是生物體中包括動(dòng)物、植物以及微生物在內(nèi)的所有有生物質(zhì)重要的組成成分,它有著維系生命的重要功能,具有組成骨性支架、組合受體、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等眾多生物活性。微生物中如細(xì)菌中存在大量的多糖分子,它有著十分重要的各種功能。據(jù)研究其具多種生物學(xué)活性,在刺激骨髓造血、引起巨噬細(xì)胞增殖及凋亡、制作多糖菌苗、抗體及治療多種疾病等方面表現(xiàn)出非常高的使用價(jià)值。α-溶血性鏈球菌作為鏈球菌種屬的一種,也稱為甲型溶血性鏈球菌,為條件致病菌,其發(fā)酵產(chǎn)物糖肽具有較高的生物學(xué)價(jià)值,在抗腫瘤、刺激骨髓造血及調(diào)節(jié)自身免疫等方面有重要作用。凝集素是一類無免疫原性、能識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),其結(jié)合的專一性類似于抗原抗體反應(yīng)。根據(jù)凝集素的糖結(jié)合特異性,凝集素可分為七類:(1)D-甘露糖或(D-葡萄糖)組;(2)N-乙酰葡萄糖胺組;(3)N-乙酰半乳糖組;(4)D-半乳糖;(5)L-巖藻糖組;(6)唾液酸組;(7)復(fù)合糖組。凝集素具有許多重要的生物學(xué)活性,其在抗?fàn)I養(yǎng)性、防衛(wèi)功能、細(xì)胞成熟和分化標(biāo)記、腫瘤診斷及免疫組織化學(xué)等方面發(fā)揮著重要的作用。另外,植物凝集素作為一種重要的天然產(chǎn)物,是分離純化和研究糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)與功能的重要工具,是研究糖和蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制的理想模型。其在轉(zhuǎn)基因抗蟲、生物固氮、藥物開發(fā)、骨髓移植及疾病鑒定等多個(gè)方面將有著廣泛的應(yīng)用。 研究目的 在不同種類的凝集素中各選取一種有代表性的凝集素,分別是ConA、WGA、SNA、RCA-Ⅰ及PHA,應(yīng)用改良的過碘酸鈉法用辣根過氧化物酶標(biāo)記凝集素,利用凝集素的糖結(jié)合特性,檢測(cè)α-溶血性鏈球菌菌體中上述5種凝集素識(shí)別多糖分子的水平,了解進(jìn)入太空環(huán)境前及進(jìn)入太空環(huán)境后鏈球菌菌體內(nèi)多糖分子表達(dá)的狀況,旨在從多糖分子水平了解太空環(huán)境是否具有菌種的誘變作用,探討太空環(huán)境是否對(duì)鏈球菌菌體多糖分子的表達(dá)有影響,并且是否能為細(xì)菌多糖生物產(chǎn)品的篩選、增進(jìn)性能或提高產(chǎn)量等方面提供新的途徑,以及是否能為太空誘變菌生物功能的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法 1.菌種太空鏈球菌種由陜西太空生物制藥工程技術(shù)研究中心提供。系在普通α-溶血性鏈球菌種中,挑選產(chǎn)量高、敏感性大、變異幅度廣的菌株處理后,置入培養(yǎng)基封裝,裝入神舟飛船返回艙內(nèi),進(jìn)行數(shù)天軌道運(yùn)行(近地點(diǎn)高度200公里、遠(yuǎn)地點(diǎn)高度350公里)后返回。然后經(jīng)過多次搭載不同的衛(wèi)星進(jìn)入太空環(huán)境供其誘變,并反復(fù)挑選得到的正變異太空菌種。將上述兩菌種經(jīng)過鈷60照射9000GY后滅活,保存于—80℃冰箱超低溫保存,待檢。 2.菌種的破碎,蛋白多糖分子的提取采用超聲波破碎法破碎細(xì)菌,離心取上清,然后應(yīng)用鹽溶法提取蛋白多糖分子,上清中加入硫酸銨至飽和度為60%～90%,繼續(xù)攪拌10～30 min,4℃靜置3～5 h,離心,將沉淀溶于蒸餾水,采用Sevage法脫除游離蛋白,離心收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除殘余溶劑,4℃透析,冷凍干燥,得蛋白多糖粉末。計(jì)算細(xì)菌破碎率及蛋白多糖獲取率。 3.凝集素的標(biāo)記采用改良的過碘酸鈉法用HRP標(biāo)記凝集素,標(biāo)記后經(jīng)過Sephadex G-200層析柱,行蛋白凝膠電泳檢測(cè)酶標(biāo)凝集素標(biāo)記后通過親和層析法的過濾效果,測(cè)酶標(biāo)抗體標(biāo)記率及ELISA測(cè)效價(jià)。 4.多糖分子的檢測(cè)檢測(cè)方法蛋白多糖分子-HRP標(biāo)記凝集素法(類似直接法ELISA),利用菌體蛋白多糖分子包被96孔酶標(biāo)板,加入標(biāo)記好的HRP-凝集素,充分結(jié)合,洗脫未結(jié)合的酶標(biāo)凝集素,通過TMB-H_2O_2溶液顯色,測(cè)吸收值,菌體中的多糖分子越多,與HRP標(biāo)記的凝集素就結(jié)合越多,經(jīng)過顯色后OD值就越高,反之就越低。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理文中所有OD值數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(—x±s)表示,用SPSS13.0軟件包檢驗(yàn)分析,采用的具體統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),結(jié)果以P≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,若P＞0.05認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究?jī)?nèi)容及結(jié)果 1.菌種的破碎,蛋白多糖分子的提取 結(jié)果:根據(jù)公式計(jì)算細(xì)菌相對(duì)破碎率=(1-超聲后細(xì)菌沉淀濕重/超聲前細(xì)菌沉淀濕重)、蛋白多糖得率=蛋白多糖/細(xì)菌重量×100%;得出細(xì)菌相對(duì)破碎率為99%,蛋白多糖得率:地面鏈球菌為1.36%,太空鏈球菌為1.58%。 2.凝集素的標(biāo)記 結(jié)果:HRP-凝集素標(biāo)記率(測(cè)OD403nm/OD280nm得標(biāo)記率)分別為0.73、0.78、0.75、0.73及0.75;用ELISA檢測(cè)酶標(biāo)凝集素效價(jià)分別為1:1000、1:000、1:1000、1:800和1:600。 3.兩菌種多糖分子得檢測(cè)結(jié)果 (1)地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得ConA相關(guān)末端N-高甘露糖型多糖分子的OD值為:0.97±0.05,太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為1.18±0.03,陽性對(duì)照組OD值為1.46±0.05,陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00,兩菌種OD值比較,P值為0.000,小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (2)地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得WGA相關(guān)末端GlcNAc多糖分子的OD值為:1.16±0.04,太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為1.16±0.03,陽性對(duì)照組OD值為1.46±0.03,陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00,兩菌種OD值比較,P值為0.967,大于0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得SNA相關(guān)末端Neu5Aca2-6Gal多糖分子的OD值為:0.56±0.03,太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為0.75±0.04,陽性對(duì)照OD值為1.35±0.04,陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00,兩菌種OD值比較,P值為0.000,小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (4)地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得RCA-Ⅰ相關(guān)末端Galβ1-4 GlcNAc多糖分子的OD值為:1.19±0.06,太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為1.38±0.08,陽性對(duì)照組OD值為1.42±0.05,陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00,兩菌種OD值比較,P值為0.001,小于0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (5)地面普通鏈球菌菌體蛋白多糖中測(cè)得PHA相關(guān)末端Gal-NAC多糖分子的OD值為:0.85±0.06,太空型鏈球菌菌體蛋白多糖中該多糖分子的OD值為0.84±0.05,陽性對(duì)照組OD值為1.44±0.06,陰性對(duì)照組OD值為0.05±0.00,兩菌種OD值比較,P值為0.664,大于0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 主要結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用改良的過碘酸鈉法利用辣根過氧化物酶標(biāo)記各種凝集素,采用超聲波法行細(xì)菌破碎,鹽溶法提取菌體蛋白多糖分子,然后根據(jù)凝集素能特異性檢測(cè)相關(guān)多糖分子的原理,利用凝集素是一類無免疫原性、能識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),其結(jié)合的專一性類似于抗原抗體反應(yīng),利用類似ELISA法的原理,用HRP標(biāo)記的凝集素法檢測(cè)檢測(cè)兩菌種蛋白多糖分子。本實(shí)驗(yàn)中選用ConA結(jié)合N-高甘露糖型多糖分子、WGA結(jié)合末端GlcNAc多糖分子,SNA可結(jié)合末端相關(guān)Neu5Aca2-6Gal多糖分子,RCA-Ⅰ結(jié)合末端Galβ1-4 GlcNAc多糖分子及PHA可結(jié)合末端Gal-NAC多糖分子的原理特性,檢測(cè)普通型α-溶血性鏈球菌及太空型鏈球菌菌體內(nèi)的多糖分子水平差異,研究?jī)煞N鏈球菌體內(nèi)多糖分子表達(dá)的情況, 結(jié)論顯示: 1、從多糖分子水平證實(shí)了太空環(huán)境具有對(duì)α-溶血性鏈球菌的誘變作用; 2、實(shí)驗(yàn)證明太空環(huán)境對(duì)α-溶血性鏈球菌多糖分子的表達(dá)有選擇性影響作用,能使ConA相關(guān)N-高甘露糖型多糖分子、SNA相關(guān)末端Neu5Aca2-6Gal多糖分子及RCA-Ⅰ相關(guān)末端Galβ1-4GlcNAc多糖分子的表達(dá)增加;對(duì)WGA相關(guān)末端GlcNAc多糖分子及PHA相關(guān)末端Gal-Nac多糖分子的表達(dá)無影響。 3、根據(jù)太空環(huán)境對(duì)細(xì)菌多糖分子表達(dá)的影響作用,為細(xì)菌多糖生物產(chǎn)品的篩選、提高性能或提高產(chǎn)量等方面提供新的可能途徑,并為太空誘變菌生物功能的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù); 4、太空環(huán)境對(duì)鏈球菌多糖分子表達(dá)影響的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：太空誘變 鏈球菌 多糖 凝集素
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R85
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-25
• 第一節(jié) 太空誘變研究歷史和現(xiàn)狀17-19
• 第二節(jié) 凝集素概述19-21
• 第三節(jié) 細(xì)菌多糖研究現(xiàn)狀21-23
• 第四節(jié) 太空誘變研究的意義23-25
• 第一部分 菌種的收集及細(xì)菌計(jì)數(shù)25-30
• 材料與方法25-28
• 結(jié)果28-29
• 討論29-30
• 第二部分 細(xì)菌蛋白多糖的提取30-34
• 材料與方法30-31
• 結(jié)果31-32
• 討論32-34
• 第三部分 凝集素辣根過氧化物酶的標(biāo)記34-43
• 材料與方法34-38
• 結(jié)果38-42
• 討論42-43
• 第四部分 菌體多糖分子的檢測(cè)43-50
• 材料與方法43-47
• 結(jié)果47-48
• 討論48-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 綜述56-66
• 附錄 中英文對(duì)照縮略詞表66-67
• 攻讀學(xué)位期間成果67-68
• 致謝68-70
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明70

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：718108