本文關(guān)鍵詞：TLR4信號通路在大鼠慢性應(yīng)激心肌損傷中作用的研究

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【摘要】：一、研究背景和目的 應(yīng)激為機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)。軍事應(yīng)激是指軍人在完成軍事任務(wù)過程中對極端惡劣生存環(huán)境、精神超負(fù)荷緊張及超強(qiáng)度作業(yè)等在內(nèi)的多種因素反應(yīng)過程,包括心理、生理上的變化。適度應(yīng)激反應(yīng)往往能活化思維、提高軍人的警覺性和作業(yè)效率,但當(dāng)應(yīng)激壓力導(dǎo)致軍人的認(rèn)知、情緒和行為發(fā)生改變、嚴(yán)重降低作業(yè)效率時,則表現(xiàn)為軍事應(yīng)激障礙。 心臟是應(yīng)激作用的主要靶器官之一。研究發(fā)現(xiàn)多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展與應(yīng)激機(jī)制的激活密切相關(guān),神經(jīng)體液因素特別是炎癥細(xì)胞因子的釋放是重要機(jī)制。Toll樣受體是一種膜受體,在機(jī)體防感染免疫中起關(guān)鍵作用,能被機(jī)體“危險”信號如:應(yīng)激、損傷、壞死等激活。在心臟中主要表達(dá)TLR4。TLR4激活使得信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi),在一系列酶的作用下,NF-κB活化,轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中誘導(dǎo)特定基因的表達(dá),導(dǎo)致炎癥因子產(chǎn)生。 TLR4/NF-κB通路在慢性應(yīng)激心臟中的作用還不清楚。為搞清上述問題,本課題建立了大鼠慢性應(yīng)激模型,觀察慢性應(yīng)激對心肌的影響,研究TLR4/NF-κB、IL-6、TNF-α等和心肌損傷的關(guān)系,希望探索TLR4/NF-κB在慢性應(yīng)激心臟中的作用,為慢性應(yīng)激致心肌損傷防治提供實驗依據(jù)。 二、材料和方法: 第一部分:軍事訓(xùn)練應(yīng)激對戰(zhàn)士心血管系統(tǒng)影響的觀察選取連隊健康男性戰(zhàn)士64人,年齡18-20歲,同時選取健康男戰(zhàn)士10名做對照。軍事訓(xùn)練應(yīng)激為3公里越野加5分鐘數(shù)學(xué)運算,軍事訓(xùn)練前后檢測BP、HR、EKG和SCL-90量表,并于訓(xùn)練后抽血查血常規(guī)、C-RP、心肌酶譜、ACTH、皮質(zhì)醇、TNF-α、IL-6。對照組只抽血,不參加軍事訓(xùn)練。 第二部分:大鼠慢性應(yīng)激致心肌損傷及NAC防治作用研究 選用雄性SD大鼠,6-7周齡,體重180-220g,動物隨機(jī)分為對照組和實驗組,實驗組又分為應(yīng)激1d、1w、2w、3w、4w、NAC組,每組8只。實驗組采用每天束縛6h+強(qiáng)迫游泳15min應(yīng)激模式,NAC組在應(yīng)激同時每日給予NAC150mg/kg灌胃,持續(xù)2周。實驗期間每3天稱1次體重,每天觀察大鼠行為變化。 各組于試驗結(jié)束次日處死大鼠。處死前連續(xù)記錄5分鐘心率、EKG變化,記錄血壓變化。分離血清,同時留取心尖部心肌標(biāo)本做TLR4 mRNA、NF-κB、電鏡、病理和心肌勻漿等檢查。對照組不應(yīng)激,和實驗組大鼠同時處死取材。 心肌酶CK測定采用ABC-ELISA方法,LDH、AST用全自動生化分析儀自動檢測。HE染色觀察病理形態(tài)變化,同時根據(jù)心肌出血、水腫和滲出情況對心肌損傷進(jìn)行評分,透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。采用Tunel法觀察心肌細(xì)胞凋亡情況,用免疫組化方法觀察心肌組織iNOS表達(dá)。 第三部分:TLR4信號通路在慢性應(yīng)激大鼠心肌表達(dá)和意義的研究 實驗動物及分組同第二部分。用RT-PCR方法測定心肌TLR4mRNA表達(dá),用EMSA方法測定心肌NF-κB活性,用ELISA方法測定心肌勻漿TNF-α、IL-6含量,用免疫組化方法觀察心肌組織TNF-α、IL-6表達(dá)。 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,樣本均數(shù)比較用t檢驗,組間比較用單因素方差分析,P 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計意義。 三、結(jié)果: 第一部分: 急性軍事訓(xùn)練前后對比,應(yīng)激后戰(zhàn)士HR(次/分)增快(82.17±15.38 vs 69.70±10.19, P0.01),DBP(mmHg)(78.90±8.40 vs74.68±8.68, P0.01)升高。C-RP(mg/L)和對照組比較升高(2.05±9.36 vs 1.56±0.95,P0.05)。6名戰(zhàn)士EKG表現(xiàn)為竇性心動過速,1名表現(xiàn)為頻發(fā)房性早搏、短陣二聯(lián)律,1名表現(xiàn)為ST段抬高,其中V1導(dǎo)聯(lián)0.2mV。SCL-90量表9項分?jǐn)?shù)每項和訓(xùn)練前比,均無顯著性差異。訓(xùn)練后血漿ACTH、皮質(zhì)醇、心肌酶譜、HB、HCT、WBC、TNF-α、IL-6等和對照組相比,無顯著性差異。 第二部分: 1、建立了“束縛+強(qiáng)迫游泳”慢性應(yīng)激大鼠模型。應(yīng)激大鼠出現(xiàn)明顯行為變化,體重增長明顯減慢,血清皮質(zhì)酮含量(nmol/L)從應(yīng)激2周開始逐漸升高,應(yīng)激2、3、4周和對照組比較差異有顯著性(80.35±15.63,88.64±13.21,85.68±26.38 vs 63.04±9.91, P0.05,P0.05,P0.05)。 2、應(yīng)激大鼠EKG變化:在應(yīng)激1天組觀察到3例室上性心動過速,4周組觀察到1例室上性心動過速,在應(yīng)激3、4周組,各觀察到1例室性早搏,在NAC組觀察到1例房顫。 3、慢性應(yīng)激大鼠心肌酶學(xué)和病理、超微結(jié)構(gòu)變化 和對照組比較,血漿CK(u/L)在應(yīng)激1天組(595.51±53.78 vs 466.95±83.19,P0.05)和1周組(574.61±50.33 vs 466.95±83.19, P0.05)明顯升高,血漿LDH(u/L)在應(yīng)激1周組明顯升高(4132.67±716.99 vs 1616.80±672.99, P0.01),血漿AST(u/L)在應(yīng)激1天組(370.5±125.02 vs131.6±36.24,P0.01)和1周組明顯升高(260.40±98.77 vs 131.6±36.24, P0.01)。 病理結(jié)果顯示:應(yīng)激后大鼠心肌HE染色表現(xiàn)為心肌濁腫,間質(zhì)血管擴(kuò)張充血,心內(nèi)膜下部分區(qū)域水腫,部分心內(nèi)膜及瓣膜黏液變性,以應(yīng)激1、2、3周組表現(xiàn)明顯。應(yīng)激2周組心肌損傷總評分較對照組明顯增高(7.3±1.6 vs 2.7±0.5, p0.01)。電鏡結(jié)果顯示:內(nèi)皮細(xì)胞變性,心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞核濃縮,心肌細(xì)胞水腫,細(xì)胞外基質(zhì)成分溶解消失,胞質(zhì)、線粒體腫脹,內(nèi)皮下結(jié)締組織增厚,可見脂質(zhì)沉積。以應(yīng)激3、4周組表現(xiàn)明顯。 4、應(yīng)激1d、1w、2w、3w、4w周組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)和對照組比較明顯增加,差異有顯著性( 27.13%±5.12%, 34.82%±7.98%, 31.51%±15.31%, 21.15%±2.60%, 25.83%±3.77% vs 10.31%±2.01%。P0.01, P0.01, P0.01, P0.05, P0.01),應(yīng)激各組心肌均有iNOS表達(dá),以1-3周最明顯。 5、NAC干預(yù)后,應(yīng)激心肌心內(nèi)膜病理改變明顯減輕,水腫減輕,滲出減少,NAC治療組心肌損傷評分總分較2周應(yīng)激組明顯減低(4.2±0.5vs7.3±1.6,P 0.01),但仍高于對照組(4.2±0.5vs2.7±0.5, P 0.01)。NAC組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少,和2周應(yīng)激組比較,差異有顯著性(16.01%±2.66% vs 31.51%±15.31% , P0.05), NAC組心肌細(xì)胞iNOS表達(dá)也較2周應(yīng)激組減少。 第三部分: 1、應(yīng)激大鼠心肌TIR4mRNA表達(dá)增高。TLR4表達(dá)在應(yīng)激1周組升高,持續(xù)到3周組,4周組降到正常水平,1-3周組表達(dá)情況和對照組相比,差異有顯著性(1.15±0.30,1.10±0.19,1.18±0.29 vs 0.88±0.10。P0.05,P0.05,P0.05)。應(yīng)激大鼠心肌NF-κB活性增強(qiáng)。NF-κB活性在應(yīng)激1天組增高,應(yīng)激1周組降低,,應(yīng)激2周組又升高,此后逐漸下降, 4周組下降到正常水平。應(yīng)激1天組、2周組(7.75×105±3.31×105,6.96×105±3.08×105)和對照組(2.65×105±1.47×105)相比差異有顯著意義(P0.01,P0.01)。 應(yīng)激大鼠心肌TNF-α和IL-6含量增高,表達(dá)增強(qiáng)。心肌勻漿IL-6和TNF-a水平在慢性應(yīng)激后逐漸升高,至4周達(dá)高峰,和對照組相比,4周組IL-6(pg/g protein)(2174.28±742.14 vs 1285.14±462.4,P0.05)和TNF-a(ng/g protein)(6.69±1.90 vs 3.80±2.35, P0.05)水平均升高。免疫組化顯示應(yīng)激各組心肌胞漿中均可見TNF-a和IL-6表達(dá)。 2、NAC治療組NF-κB活性和應(yīng)激2周組比較有明顯降低,心肌勻漿IL-6(pg/g protein)(801.42±115.58 vs 1835.95±834.95, P0.01)和TNF-a(ng/g protein)(1.30±0.60 vs 5.48±1.88, P0.01)水平較應(yīng)激組明顯降低。 四、結(jié)論 1、軍事訓(xùn)練急性應(yīng)激后戰(zhàn)士出現(xiàn)了心率增快、舒張壓升高等表現(xiàn),C-RP升高,部分戰(zhàn)士EKG出現(xiàn)了竇性心動過速、頻發(fā)房性早搏、ST段抬高等表現(xiàn)。說明軍事訓(xùn)練后可以出現(xiàn)心血管方面的改變。 2、成功建立了大鼠“束縛+強(qiáng)迫游泳”慢性應(yīng)激模型。應(yīng)激大鼠皮質(zhì)酮含量從應(yīng)激后2周開始升高,出現(xiàn)了明顯的焦慮、倦怠、反應(yīng)低下、食欲減少、體重增長減慢等變化。 3、慢性應(yīng)激大鼠血漿心肌酶升高,心肌病理和超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了改變,心肌細(xì)胞凋亡增加,部分大鼠出現(xiàn)了室上性心動過速、室性早博、房顫等心律失常表現(xiàn),表明慢性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠心肌損傷。 4、慢性應(yīng)激大鼠心肌TLR4表達(dá)增高,NF-κB活性增強(qiáng),心肌IL-6、TNF-α含量和表達(dá)增高。應(yīng)用NAC可抑制NF-kB的活性和IL-6、TNF-α的表達(dá),減輕心肌損傷。說明TLR4/NF-κB信號通路的激活可能是慢性應(yīng)激心肌損傷的重要機(jī)制,并可能是防治慢性應(yīng)激致心肌損傷的新的靶點。
【關(guān)鍵詞】：慢性應(yīng)激 心肌損傷 TLR4 NF-kB TNF-α IL-6
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R82
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表6-10
• 英文摘要10-16
• 中文摘要16-20
• 前言20-22
• 第一部分 急性軍事訓(xùn)練應(yīng)激對戰(zhàn)士心血管系統(tǒng)影響的觀察22-32
• 材料和方法22-25
• 結(jié)果25-27
• 討論27-32
• 第二部分 大鼠慢性應(yīng)激致心肌損傷及NAC 防治作用研究32-56
• 實驗一 慢性應(yīng)激大鼠動物模型的建立32-37
• 材料和方法32-33
• 結(jié)果33-37
• 實驗二 慢性應(yīng)激大鼠心肌損傷的觀察37-46
• 材料和方法37-40
• 結(jié)果40-46
• 實驗三 NAC 干預(yù)對慢性應(yīng)激大鼠心肌損傷保護(hù)作用的研究46-51
• 材料和方法46-47
• 結(jié)果47-51
• 討論51-56
• 第三部分 TLR4 信號通路在慢性應(yīng)激大鼠心肌表達(dá)和意義的研究56-77
• 實驗四 慢性應(yīng)激大鼠心肌TLR4mRNA 表達(dá)的觀察56-60
• 材料和方法56-59
• 結(jié)果59-60
• 實驗五 慢性應(yīng)激大鼠心肌NF-κB 活性的變化60-68
• 材料和方法60-66
• 結(jié)果66-68
• 實驗六 慢性應(yīng)激大鼠心肌IL-6、TNF-α含量和表達(dá)68-72
• 材料和方法68-69
• 結(jié)果69-72
• 實驗七 NAC 干預(yù)對慢性應(yīng)激大鼠心肌NF-κB 活性的影響72-74
• 材料和方法72
• 結(jié)果72-74
• 討論74-77
• 全文結(jié)論77-78
• 參考文獻(xiàn)78-89
• 致謝89-90
• 文獻(xiàn)綜述90-104
• 參考文獻(xiàn)98-104
• 博士研究生期間發(fā)表的論文104-105

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8 翟洪波;徐鍵;;TLR2和TLR4在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛和蛻膜中的表達(dá)及其意義[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2011年06期

9 余國膺;;應(yīng)激內(nèi)分泌造成表觀遺傳改變[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2011年03期

10 鄧存良;陳p，

本文編號：683791