本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)研究兔外周血單核細(xì)胞熱適應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)

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【摘要】： 高溫作為軍事職業(yè)危害因素日益受到重視，人體在高溫條件下適應(yīng)與耐受能力的研究成為熱點(diǎn)。在熱環(huán)境下，機(jī)體的代謝、免疫狀態(tài)將發(fā)生改變，細(xì)胞出現(xiàn)一系列生理、生化、結(jié)構(gòu)和功能的改變，以增強(qiáng)抗損傷能力，保持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，使機(jī)體逐漸適應(yīng)熱環(huán)境。傳統(tǒng)技術(shù)在研究人與動(dòng)物熱應(yīng)激及熱適應(yīng)過(guò)程的病理生理機(jī)制過(guò)程中，已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但熱適應(yīng)過(guò)程的諸多分子生物及生化機(jī)制仍未完全闡明。目前已知在有害因素刺激下以及在適應(yīng)過(guò)程中，一些基因調(diào)控機(jī)制扮演著十分重要的角色。推測(cè)其主要通過(guò)一些調(diào)控蛋白、因子(如一些酶類、激素等)的差異表達(dá)(異位表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng))來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)與抗損傷能力。因此研究熱應(yīng)激及熱適應(yīng)過(guò)程基因的差異表達(dá)，有重要的科學(xué)意義。 目的：應(yīng)用分辨率高的抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)，探討兔外周血單核細(xì)胞熱適應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)，為提高熱適應(yīng)能力和尋找相關(guān)的生物標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。 方法：常規(guī)方法建立兔熱適應(yīng)模型，分別于兔熱適應(yīng)前和熱適應(yīng)后取其外周血，分離單核細(xì)胞，提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后利用SMART~(TM)技術(shù)合成cDNA，酶切后分別連接不同的接頭，進(jìn)行兩步消減雜交、兩輪PCR來(lái)擴(kuò)增差異表達(dá)基因片斷，構(gòu)建消減cDNA文庫(kù)，最后應(yīng)用differential screening技術(shù)對(duì)所構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行篩選，鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，登陸GeneBank進(jìn)行同源性比較。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)兔獲得了充分的熱適應(yīng);分別從熱適應(yīng)前、后兔外周血中分離 了高純度的單核細(xì)胞，并提取了高質(zhì)量的總RNA，完整反轉(zhuǎn)錄為全長(zhǎng)。DNA。Rsa I酶切徹底，獲得長(zhǎng)度均一性較好的短片斷。高效連接特定接頭，，經(jīng)過(guò)連續(xù)兩 輪PCR消減雜交，構(gòu)建了上調(diào)、下調(diào)的熱適應(yīng)相關(guān)基因消減cDNA文庫(kù)。隨后 的兩輪PCR擴(kuò)增特異性高，使差異表達(dá)基因得到了指數(shù)擴(kuò)增。產(chǎn)物連接T載體 并成功轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，使文庫(kù)中的差異表達(dá)基因得到有效分離。從上調(diào) 表達(dá)消減文庫(kù)中初步選取96個(gè)克隆進(jìn)行篩選，利用Differentials。reening 鑒定后確定7個(gè)克隆含有差異表達(dá)基因。測(cè)序結(jié)果提交GeneBank進(jìn)行同源性 對(duì)比分析，確定差異表達(dá)基因的編碼蛋白，以及確認(rèn)新基因。最后分析顯示1 個(gè)為未知基因，另6個(gè)為已知基因。 結(jié)論:成功應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)研究動(dòng)物研究了熱適應(yīng)兔外周血單核 細(xì)胞熱適應(yīng)相關(guān)基因的差異表達(dá)，構(gòu)建了外周血單核細(xì)胞熱適應(yīng)相關(guān)基因的上 調(diào)、下調(diào)cDNA消減文庫(kù)。發(fā)現(xiàn)了線粒體細(xì)胞色素。氧化酶亞單位(C 011)編 碼基因、線粒體ATP合成酶6(ATPse6)編碼基因、線粒體165 rRNA、125 rRNA 編碼基因、蛋白激酶B(PKB)編碼基因、p一2微球蛋白(BZM)編碼基因片斷 等在熱適應(yīng)過(guò)程中的上調(diào)表達(dá)。另發(fā)現(xiàn)了1個(gè)未知新基因片斷在熱適應(yīng)過(guò)程中 表達(dá)上調(diào)，但具體功能仍有待于進(jìn)一步的研究闡明。研究表明基因調(diào)控在熱應(yīng) 激及熱適應(yīng)過(guò)程扮演著重要的角色，同時(shí)也證明SSH技術(shù)能夠高效地將差異表 達(dá)基因分離擴(kuò)增。
【關(guān)鍵詞】：兔 熱適應(yīng) 抑制性消減雜交 單核細(xì)胞 基因
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R82
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表4-5
• 摘要5-10
• 前言10-15
• 第一部分15-47
• 材料與方法15-36
• 結(jié)果36-43
• 討論43-47
• 第二部分47-76
• 材料與方法47-54
• 結(jié)果54-71
• 討論71-76
• 結(jié)論76-77
• 參考文獻(xiàn)77-80
• 致謝80-81
• 綜述81-87

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 孫春曉,于常海;基因克隆的常用方法介紹[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2000年01期

2 杜桂仙,邱玉明,張智勇;熱適應(yīng)形成中的神經(jīng)化學(xué)機(jī)制:熱適應(yīng)兔腦室灌流液降低肛溫的效應(yīng)[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;1991年01期

3 杜桂仙,張智勇,奚金寶,邱玉明;致熱適應(yīng)因子誘發(fā)熱適應(yīng)體溫降低機(jī)制的探討[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;1993年01期

本文編號(hào)：643570