本文關(guān)鍵詞：模擬微重力狀態(tài)下過氧化物酶體增殖物激活受體γ基因表達(dá)對成骨分化的影響

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【摘要】：研究背景 微重力又稱零重力,是相對于地球表面1g重力環(huán)境而言的一種“零重量”狀態(tài),也是人類在太空工作及生活所處的環(huán)境。人類長時間處于微重力狀態(tài)下可引起各種病理生理變化,其中包括骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、免疫功能下降等,而骨質(zhì)疏松癥是其中最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。據(jù)報道,空間飛行中平均每月出現(xiàn)2%的骨丟失,相當(dāng)于絕經(jīng)后婦女1年的骨丟失,且返回地面后骨丟失持續(xù)存在,這嚴(yán)重影響到飛行員健康。國內(nèi)外現(xiàn)有研究認(rèn)為,微重力誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)病機(jī)制是空間飛行導(dǎo)致成骨細(xì)胞(OB)形狀及結(jié)構(gòu)明顯改變,細(xì)胞多呈現(xiàn)濃縮核或核分散,由于重力作用而導(dǎo)致破骨細(xì)胞活化引起骨吸收增加,成骨細(xì)胞完整性及礦化結(jié)節(jié)形成功能缺失�，F(xiàn)有的藥物、物理治療未能起到理想的治療效果,極大地限制了今后的航天載人事業(yè)發(fā)展及人類長期在太空工作、生活。為探求其他防治失重性骨質(zhì)疏松的方法,模擬微重力下骨代謝及細(xì)胞信號通路的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一。 1990年Issemann[2]等首先發(fā)現(xiàn)了一類能被脂肪酸樣化合物過氧化物酶體增殖劑(peroxisome proliferators, PP)激活,而被命名為PP激活受體(peroxisome prolifemtor-activated receptor, PPAR)。 PPAR是一類廣泛參與糖脂調(diào)節(jié)、脂肪儲存基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子,屬于核受體超家族成員。在兩棲類、嚙齒類及人類PPARs由于基因的啟動子和拼接方式不同均存在3種亞型,即PPAR a、 PPARβ(亦稱PPARδ或NUC-1)和PPARγ。PPARγ主要表達(dá)于脂肪組織,在胰島B細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞也有表達(dá),已被公認(rèn)在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化與糖、脂肪及能量等多種代謝中起重要作用,其基因位于染色體3p25。PPARγmRNA含有9個外顯子,基因組DNA全長約100kb,存在著4種異構(gòu)體即PPARγ-1、PPARγ-2、PPARγ-3和PPARγ-4。近年來有研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)還與激活蛋白21(AP21)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1(STAT1)、Fos蛋白家族成員δFosB蛋白、細(xì)胞周期素D等因子及Wnt信號通路協(xié)同作用調(diào)控細(xì)胞的分化、生長和凋亡,其中包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化過程。PPARγ信號通路可通過激活或關(guān)閉下游信號調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化方向,即增加或減少干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞數(shù)量。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,具有多向分化潛能,可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。 噻唑烷二酮類藥物作為PPARγ細(xì)胞信號通路的人工合成受體,在極低劑量下(毫微克分子)即可激活PPARγ細(xì)胞信號通路。吡格列酮作為噻唑烷二酮類藥物代表之一,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于糖尿病治療,選取其作為實(shí)驗(yàn)用PPARγ細(xì)胞信號通路激動劑,更具有臨床意義。GW9662是PPARγ細(xì)胞信號通路常用的抑制劑,其效果被國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)所肯定而廣泛應(yīng)用于抑制PPARγ細(xì)胞信號通路。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合于微載體上,在模擬微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)中進(jìn)行向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo),通過激活及抑制PPARγ通路,檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化過程中所受的影響。期望本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為骨質(zhì)疏松癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)一步積累科學(xué)依據(jù)及提供可能的新治療方向。 目的 觀察過氧化物酶體增殖物激活受體γ細(xì)胞通路在體外模擬微重力狀態(tài)下對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響及吡格列酮、GW9662對氧化物酶體增殖物激活受體丫基因表達(dá)的影響。對象和方法 1.BMSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增：取材5周齡SD大鼠股骨及脛骨骨髓作BMSCs原代培養(yǎng),沖出的骨髓細(xì)胞懸液裝入預(yù)先準(zhǔn)備的15ml離心管,室溫下以1000r/min離心5min,棄上清、脂肪及雜質(zhì),F12/DMEM重懸,洗滌細(xì)胞；用含有10%胎牛血清的DMEM/F12重懸細(xì)胞,接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,加入完全培養(yǎng)液(10%FCS、青霉素G100U/ml,鏈霉素100U/ml的DMM/F12培養(yǎng)基),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。依據(jù)貼壁培養(yǎng)法分離和進(jìn)行細(xì)胞傳代,取第4-5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對象。 2.BMSCs性質(zhì)鑒定：采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測細(xì)胞表面CD29、CD34、CD44分子表達(dá)并繪制成流式圖。 3.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為：正常重力組(NG)、模擬微重力組(MG)、模擬微重力+10μmol/L吡格列酮組(MG+PIO)、模擬微重力+10μmol/L GW9662組(MG+GW)、模擬微重力+10μmol/L吡格列酮+10μmol/L GW9662組(MG+PIO+GW)。正常重力組在正常重力下以貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)14d,模擬微重力組和模擬微重力+吡格列酮和(或)GW9662組均在旋轉(zhuǎn)式重力反應(yīng)器中模擬微重力培養(yǎng)14d。細(xì)胞培養(yǎng)14d后,實(shí)驗(yàn)組均用2ml0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液在37℃下消化1-2min,離心收集OB進(jìn)行檢測。 4.觀察各組14d后使用茜素紅染色檢測成骨結(jié)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性檢測、油紅-O染色檢測脂肪細(xì)胞及計算成脂率、兩步法RT-PCR(半定量反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng))檢測PPARγ基因的m R N A表達(dá)情況。 5.統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,多組均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計資料的方差分析,描述性統(tǒng)計分析單因素方差分析(One Way) ANOVA及LSD方法進(jìn)行多樣本均數(shù)兩兩比較,方差齊性采用Levene檢驗(yàn)。P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.BMSCs生長情況：原代大鼠BMSCs接種后,細(xì)胞形態(tài)大小不一,呈圓型。24小時換液后,細(xì)胞貼壁生長3d,可觀察到成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞集落,細(xì)胞伸出長短不一,粗細(xì)不均的突起,胞漿豐富,胞核大,核仁清晰,每隔兩天在無菌條件下進(jìn)行全量換液以祛除雜質(zhì)。7至9d后細(xì)胞呈集落生長,呈同向旋渦狀排列。10至12d后細(xì)胞排列緊密,逐漸融合成片。進(jìn)行細(xì)胞傳代純化培養(yǎng),每隔3至4d科傳代一次,連續(xù)傳代4-5代后,細(xì)胞生長旺盛,形態(tài)均一,呈梭形生長,胞漿豐富,細(xì)胞核明顯,每個細(xì)胞有一兩個核仁。 2. BMSCs'性質(zhì)鑒定：采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD分子表達(dá),結(jié)果顯示CD29(99.52%)、CD34(0.58%)、、CD44(41.88%),鑒定結(jié)果顯示出間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,CD34間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)陰性,而CD29、CD44間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)陽性。以上結(jié)果與李曉峰等結(jié)果一致,可證實(shí)其為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。同時將BMSCs加入成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)液,進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化鑒定。 3.成骨細(xì)胞的鑒定：經(jīng)成骨誘導(dǎo)液連續(xù)分化培養(yǎng)14d后,茜素紅染色后在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)紅色或褐色礦化結(jié)節(jié)。模擬微重力組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較正常重力組減少,模擬微重力+吡格列酮組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較微重力組明顯減少,細(xì)胞排列紊亂,模擬微重力+GW9662組視野內(nèi)可見礦化結(jié)節(jié)較模擬微重力組輕微增多,模擬微重力+吡格列酮+GW9662組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較模擬微重力組增加,與模擬微重力+GW9662組相比減少。 4.堿性磷酸酶(ALP)活性檢測：與正常重力組相比,模擬微重力培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),模擬微重力培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組別堿性磷酸酶活性降低。與模擬微重力組相比,模擬微重力+吡格列酮組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001),模擬微重力+GW9662組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。與模擬微重力+毗格列酮組相比,模擬微重力+GW9662組及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 5.脂肪細(xì)胞的鑒定及成脂率計算：與正常重力組相比,模擬微重力培養(yǎng)的細(xì)胞中脂肪細(xì)胞數(shù)量及成脂率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),模擬微重力培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組別成脂率升高。與模擬微重力組相比,模擬微重力+吡格列酮組及模擬微重力+GW9662組的成脂率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),模擬微重力+吡格列酮組成脂率升高,模擬微重力+GW9662組的成脂率降低。與模擬微重力+吡格列酮組相比,模擬微重力+GW9662組及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組的成脂率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),均低于模擬微重力+吡格列酮組。 6.OB的PPARγ的mRNA的表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示：與正常重力組相比,模擬微重力組及模擬微重力+吡格列酮組PPARγ的mRNA表達(dá)均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與模擬微重力+吡格列酮組相比,模擬微重力組、模擬微重力+吡格列酮組及模擬微重力+毗格列酮+GW9662組PPARγ的mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.“全骨髓貼壁培養(yǎng)法”培養(yǎng)原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種科學(xué)有效、簡單可靠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增方法。 2.體外模擬微重力培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,降低成骨分化率,并增加干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化幾率,打破成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間平衡,使骨基質(zhì)形成、成熟和礦化作用降低,上調(diào)了PPARγ基因的mRNA表達(dá)。 3.吡格列酮可以進(jìn)一步減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,加重骨基質(zhì)形成、成熟和礦化的障礙,并上調(diào)PPARγ基因的mRNA表達(dá)。 4.GW9662可以部分逆轉(zhuǎn)模擬微重力狀態(tài)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的抑制作用,抑制脂肪細(xì)胞生成,下調(diào)PPARγ基因的mRNA表達(dá)。 5. PPARγ細(xì)胞信號通路的激活可能是造成模擬微重力誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的重要原因之一。
【關(guān)鍵詞】：模擬微重力 過氧化物酶體增殖物激活受體γ 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R85
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 前言17-22
• 第二章 材料與方法22-37
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-37
• 第三章 結(jié)果37-48
• 1 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和體外培養(yǎng)37-39
• 2 模擬微重力對體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響39-41
• 3 B比格列酮及GW9662對體外模擬微重力條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響41-48
• 第四章 討論48-55
• 第五章 結(jié)論55
• 本實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步探討問題55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 中英文對照縮略詞表61-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文62-63
• 致謝63-64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：549865