本文關鍵詞：人重組精氨酸酶活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：精氨酸酶是尿素循環(huán)過程中的關鍵酶,能夠催化精氨酸水解。近年來針對癌癥治療有一種新策略即氨基酸剝奪。精氨酸對正常細胞來說是非必需氨基酸,但對腫瘤細胞來說卻是必需氨基酸。因此精氨酸酶能夠通過消耗精氨酸來阻斷腫瘤細胞獲得所必需的營養(yǎng),從而阻礙癌細胞的發(fā)育生長,同時對正常細胞幾乎無影響,所以精氨酸酶有非常好的應用價值。因此越來越多的人開始關注精氨酸酶的研究。過去對精氨酸酶的研究主要集中在了其抑制劑的研究上,而激活劑研究方面并不多見。基于通過氨基酸剝奪來抑制腫瘤細胞這一機理,更應該加強對精氨酸酶激活劑的研究。以往的研究多集中于精氨酸酶Ⅰ,而且對其研究也多集中于活性口袋。本文針對以往較少研究的精氨酸酶激活劑,聚乙二醇化精氨酸酶Ⅰ進行了探究。定點突變得到突變型精氨酸酶Ⅰ同時發(fā)現(xiàn)了精氨酸酶Ⅰ可能存在一個位于空穴C2的調節(jié)位點。1.野生型精氨酸酶Ⅰ與突變型精氨酸酶Ⅰ的研究經過分子動力學模擬以及PCR技術對野生型精氨酸酶Ⅰ進行了定點突變,成功得到了突變型精氨酸酶Ⅰ。相對于野生型精氨酸酶Ⅰ來說,突變型精氨酸酶Ⅰ只是C2空穴容積明顯減少,對活性口袋的構象及酶整體的構象沒有明顯的干擾。根據(jù)分子模擬及L-Val對精氨酸酶的抑制作用實驗結果可推測,野生型精氨酸酶Ⅰ可能存在一個位于C2空穴內的調節(jié)位點,小分子物質可以結合在此位點,從而協(xié)同調控酶的活性。DMSO,甘氨酸,阿魏酸和谷氨酸鈉對野生型精氨酸酶Ⅰ,突變型精氨酸酶Ⅰ都有激活作用。DMSO對于野生型精氨酸酶Ⅰ和突變型精氨酸酶Ⅰ激活效果最為顯著。同時DMSO,甘氨酸,阿魏酸和谷氨酸鈉這四種物質對突變型精氨酸酶Ⅰ激活程度均大于對野生型精氨酸酶Ⅰ的激活程度。2.PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ的研究PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ較為適宜的條件為:溫度為4℃,PEG與野生型精氨酸酶Ⅰ的投料比為16:1,包埋1h。PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的分離的條件為,CM-52陽離子交換層析,梯度混合洗脫的方式來分離,梯混儀中低濃度一側是不含Na Cl的p H6.0的20mmol/L PBS,高濃度一側是含200mmol/L Na Cl的p H6.0的20m M PBS。DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸鈉對于PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ都有激活作用,DMSO對于PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ激活效果最為顯著。但是DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸鈉對PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ都不如對野生型精氨酸酶Ⅰ的影響顯著。本實驗設計得到了突變型精氨酸酶Ⅰ,發(fā)現(xiàn)精氨酸酶Ⅰ表面可能存在有別于活性口袋的另一個新的調節(jié)位點,探究了PEG修飾精氨酸酶Ⅰ以及修飾后分離的條件,同時探究了DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸鈉對野生型精氨酸酶Ⅰ,突變型精氨酸酶Ⅰ以及PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ的激活作用。本研究期望為以精氨酸酶為靶點的藥物研究提供新的思路。
【關鍵詞】：精氨酸酶Ⅰ 突變 調節(jié)位點 激活作用 聚乙二醇
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R91
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-20
• 1.1 精氨酸酶的分布及性質12-14
• 1.1.1 自然界中精氨酸酶的分布12
• 1.1.2 生物體中精氨酸酶的分布12-13
• 1.1.3 精氨酸酶的性質13-14
• 1.1.4 精氨酸酶缺乏性疾病14
• 1.2 精氨酸酶在癌癥治療方面的作用14-16
• 1.3 精氨酸酶在藥物研發(fā)及臨床應用方面的研究16-17
• 1.3.1 藥物研發(fā)16-17
• 1.3.2 臨床應用方面的研究17
• 1.4 精氨酸酶的激活劑與抑制劑17-18
• 1.4.1 精氨酸酶的激活劑17
• 1.4.2 精氨酸酶的抑制劑17-18
• 1.5 蛋白藥物的長效表達18-19
• 1.6 本論文的立題依據(jù)及研究意義19-20
• 第2章 野生型精氨酸酶Ⅰ與突變型精氨酸酶Ⅰ的研究20-38
• 2.1 實驗材料20-22
• 2.1.1 菌種和質粒20
• 2.1.2 試劑和藥品20-21
• 2.1.3 儀器和設備21-22
• 2.2 實驗方法22-27
• 2.2.1 野生型精氨酸酶Ⅰ的表達純化22-23
• 2.2.2 突變型精氨酸酶Ⅰ質粒的構建23-24
• 2.2.3 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ蛋白含量測定24-25
• 2.2.4 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ酶活力測定25
• 2.2.5 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ米氏常數(shù)測定25
• 2.2.6 L-Val對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響25-26
• 2.2.7 DMSO對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26
• 2.2.8 甘氨酸對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26
• 2.2.9 阿魏酸對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26
• 2.2.10 谷氨酸鈉對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26-27
• 2.3 結果與討論27-36
• 2.3.1 野生型精氨酸酶Ⅰ的表達純化27-28
• 2.3.2 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ的分子動力學模擬28-30
• 2.3.3 突變型精氨酸酶Ⅰ的表達純化30-31
• 2.3.4 L-Val對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響31-33
• 2.3.5 DMSO對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響33
• 2.3.6 甘氨酸對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響33-34
• 2.3.7 阿魏酸對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響34-35
• 2.3.8 谷氨酸鈉對野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響35-36
• 2.4 小結36-38
• 第3章 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ的研究38-48
• 3.1 實驗材料38
• 3.2 實驗方法38-40
• 3.2.1 PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ的條件探索38
• 3.2.2 PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的分離38-39
• 3.2.3 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ蛋白含量測定39
• 3.2.4 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ酶活力測定39
• 3.2.5 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ米氏常數(shù)測定39
• 3.2.6 DMSO對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響39
• 3.2.7 甘氨酸對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響39-40
• 3.2.8 阿魏酸對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響40
• 3.2.9 谷氨酸鈉對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響40
• 3.3 結果與討論40-46
• 3.3.1 PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ的條件探索40-42
• 3.3.2 PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的分離42-43
• 3.3.3 DMSO對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響43-44
• 3.3.4 甘氨酸對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響44-45
• 3.3.5 阿魏酸對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響45
• 3.3.6 谷氨酸鈉對PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響45-46
• 3.4 小結46-48
• 第4章 結論48-49
• 參考文獻49-56
• 研究生期間所取得的科研成果56-57
• 致謝57

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：人重組精氨酸酶活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：402799