本文關(guān)鍵詞：人重組精氨酸酶活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：精氨酸酶是尿素循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶,能夠催化精氨酸水解。近年來(lái)針對(duì)癌癥治療有一種新策略即氨基酸剝奪。精氨酸對(duì)正常細(xì)胞來(lái)說(shuō)是非必需氨基酸,但對(duì)腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)卻是必需氨基酸。因此精氨酸酶能夠通過消耗精氨酸來(lái)阻斷腫瘤細(xì)胞獲得所必需的營(yíng)養(yǎng),從而阻礙癌細(xì)胞的發(fā)育生長(zhǎng),同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)影響,所以精氨酸酶有非常好的應(yīng)用價(jià)值。因此越來(lái)越多的人開始關(guān)注精氨酸酶的研究。過去對(duì)精氨酸酶的研究主要集中在了其抑制劑的研究上,而激活劑研究方面并不多見�；谕ㄟ^氨基酸剝奪來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞這一機(jī)理,更應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)精氨酸酶激活劑的研究。以往的研究多集中于精氨酸酶Ⅰ,而且對(duì)其研究也多集中于活性口袋。本文針對(duì)以往較少研究的精氨酸酶激活劑,聚乙二醇化精氨酸酶Ⅰ進(jìn)行了探究。定點(diǎn)突變得到突變型精氨酸酶Ⅰ同時(shí)發(fā)現(xiàn)了精氨酸酶Ⅰ可能存在一個(gè)位于空穴C2的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。1.野生型精氨酸酶Ⅰ與突變型精氨酸酶Ⅰ的研究經(jīng)過分子動(dòng)力學(xué)模擬以及PCR技術(shù)對(duì)野生型精氨酸酶Ⅰ進(jìn)行了定點(diǎn)突變,成功得到了突變型精氨酸酶Ⅰ。相對(duì)于野生型精氨酸酶Ⅰ來(lái)說(shuō),突變型精氨酸酶Ⅰ只是C2空穴容積明顯減少,對(duì)活性口袋的構(gòu)象及酶整體的構(gòu)象沒有明顯的干擾。根據(jù)分子模擬及L-Val對(duì)精氨酸酶的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè),野生型精氨酸酶Ⅰ可能存在一個(gè)位于C2空穴內(nèi)的調(diào)節(jié)位點(diǎn),小分子物質(zhì)可以結(jié)合在此位點(diǎn),從而協(xié)同調(diào)控酶的活性。DMSO,甘氨酸,阿魏酸和谷氨酸鈉對(duì)野生型精氨酸酶Ⅰ,突變型精氨酸酶Ⅰ都有激活作用。DMSO對(duì)于野生型精氨酸酶Ⅰ和突變型精氨酸酶Ⅰ激活效果最為顯著。同時(shí)DMSO,甘氨酸,阿魏酸和谷氨酸鈉這四種物質(zhì)對(duì)突變型精氨酸酶Ⅰ激活程度均大于對(duì)野生型精氨酸酶Ⅰ的激活程度。2.PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ的研究PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ較為適宜的條件為:溫度為4℃,PEG與野生型精氨酸酶Ⅰ的投料比為16:1,包埋1h。PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的分離的條件為,CM-52陽(yáng)離子交換層析,梯度混合洗脫的方式來(lái)分離,梯混儀中低濃度一側(cè)是不含Na Cl的p H6.0的20mmol/L PBS,高濃度一側(cè)是含200mmol/L Na Cl的p H6.0的20m M PBS。DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸鈉對(duì)于PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ都有激活作用,DMSO對(duì)于PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ激活效果最為顯著。但是DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸鈉對(duì)PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ都不如對(duì)野生型精氨酸酶Ⅰ的影響顯著。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到了突變型精氨酸酶Ⅰ,發(fā)現(xiàn)精氨酸酶Ⅰ表面可能存在有別于活性口袋的另一個(gè)新的調(diào)節(jié)位點(diǎn),探究了PEG修飾精氨酸酶Ⅰ以及修飾后分離的條件,同時(shí)探究了DMSO,甘氨酸,阿魏酸以及谷氨酸鈉對(duì)野生型精氨酸酶Ⅰ,突變型精氨酸酶Ⅰ以及PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ的激活作用。本研究期望為以精氨酸酶為靶點(diǎn)的藥物研究提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：精氨酸酶Ⅰ 突變 調(diào)節(jié)位點(diǎn) 激活作用 聚乙二醇
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R91
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-20
• 1.1 精氨酸酶的分布及性質(zhì)12-14
• 1.1.1 自然界中精氨酸酶的分布12
• 1.1.2 生物體中精氨酸酶的分布12-13
• 1.1.3 精氨酸酶的性質(zhì)13-14
• 1.1.4 精氨酸酶缺乏性疾病14
• 1.2 精氨酸酶在癌癥治療方面的作用14-16
• 1.3 精氨酸酶在藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用方面的研究16-17
• 1.3.1 藥物研發(fā)16-17
• 1.3.2 臨床應(yīng)用方面的研究17
• 1.4 精氨酸酶的激活劑與抑制劑17-18
• 1.4.1 精氨酸酶的激活劑17
• 1.4.2 精氨酸酶的抑制劑17-18
• 1.5 蛋白藥物的長(zhǎng)效表達(dá)18-19
• 1.6 本論文的立題依據(jù)及研究意義19-20
• 第2章 野生型精氨酸酶Ⅰ與突變型精氨酸酶Ⅰ的研究20-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1 菌種和質(zhì)粒20
• 2.1.2 試劑和藥品20-21
• 2.1.3 儀器和設(shè)備21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-27
• 2.2.1 野生型精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)純化22-23
• 2.2.2 突變型精氨酸酶Ⅰ質(zhì)粒的構(gòu)建23-24
• 2.2.3 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ蛋白含量測(cè)定24-25
• 2.2.4 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ酶活力測(cè)定25
• 2.2.5 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ米氏常數(shù)測(cè)定25
• 2.2.6 L-Val對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響25-26
• 2.2.7 DMSO對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26
• 2.2.8 甘氨酸對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26
• 2.2.9 阿魏酸對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26
• 2.2.10 谷氨酸鈉對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響26-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-36
• 2.3.1 野生型精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)純化27-28
• 2.3.2 野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ的分子動(dòng)力學(xué)模擬28-30
• 2.3.3 突變型精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)純化30-31
• 2.3.4 L-Val對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響31-33
• 2.3.5 DMSO對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響33
• 2.3.6 甘氨酸對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響33-34
• 2.3.7 阿魏酸對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響34-35
• 2.3.8 谷氨酸鈉對(duì)野生型與突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響35-36
• 2.4 小結(jié)36-38
• 第3章 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ的研究38-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.2.1 PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ的條件探索38
• 3.2.2 PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的分離38-39
• 3.2.3 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ蛋白含量測(cè)定39
• 3.2.4 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ酶活力測(cè)定39
• 3.2.5 PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ米氏常數(shù)測(cè)定39
• 3.2.6 DMSO對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響39
• 3.2.7 甘氨酸對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響39-40
• 3.2.8 阿魏酸對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響40
• 3.2.9 谷氨酸鈉對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響40
• 3.3 結(jié)果與討論40-46
• 3.3.1 PEG包埋修飾野生型精氨酸酶Ⅰ的條件探索40-42
• 3.3.2 PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的分離42-43
• 3.3.3 DMSO對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響43-44
• 3.3.4 甘氨酸對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響44-45
• 3.3.5 阿魏酸對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響45
• 3.3.6 谷氨酸鈉對(duì)PEG修飾的野生型精氨酸酶Ⅰ活性的影響45-46
• 3.4 小結(jié)46-48
• 第4章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 研究生期間所取得的科研成果56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人重組精氨酸酶活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：402799