發(fā)布時間：2017-04-13 21:24

  本文關(guān)鍵詞：基于心臟組織的轉(zhuǎn)錄組學分析AEE治療大鼠血栓的調(diào)控機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：AEE是由阿司匹林和丁香酚兩種分子前體合成的一種新酯化物。研究表明AEE在抗血栓和抗炎方面比阿司匹林副作用小、毒性低,在治療和預防各種血栓性疾病中發(fā)揮著非常顯著的作用,但尚未對AEE抗血栓的作用機制及其靶基因進行研究。本研究利用腹腔注射角叉菜膠建立wistar大鼠血栓模型,將實驗大鼠分為6組,每組7只,包括10、15、20、25mg/kg和30mg/kg角叉菜膠劑量誘導血栓組,對照組注射2m L生理鹽水。在6、12、18h和24h測量血栓黑尾長度,統(tǒng)計學分析劑量和時間對血栓黑尾長度和血栓黑尾比率的影響,通過病理學觀察和血細胞形態(tài)觀察確立貼近臨床研究和病理學研究的血栓模型;利用AEE、阿司匹林、丁香酚、羧甲基纖維素鈉、阿司匹林和丁香酚藥物對血栓模型大鼠口服給藥7天,解剖大鼠獲得心臟組織,提取組織總RNA進行基因表達譜芯片分析,統(tǒng)計不同藥物對心臟組織的差異表達基因,并且做不同藥物與血栓模型組、正常組和藥物溶劑組對比的維恩圖分析。對基因表達譜芯片結(jié)果做聚類分析和信號通路分析,篩選在心臟組織中藥物共同參與的信號通路,同時確定該信號通路中重要的差異表達基因,并且結(jié)合qRT-PCR對不同藥物處理組、正常組和模型組的差異表達基因進行分析和驗證。研究獲得的主要結(jié)果如下:1.基于病理學和血細胞觀察進行藥物誘導血栓模型建立的劑量和時間研究,發(fā)現(xiàn)在環(huán)境溫度18±2℃時用角叉菜膠腹腔注射誘導血栓形成,6 h時血栓誘導率達100%。統(tǒng)計分析表明,相同劑量下,時間對血栓黑尾長度的影響不顯著(P0.05),而在相同時間情況下劑量對其影響顯著(P0.05);20 mg/kg角叉菜膠劑量較其它劑量在尾長度和黑尾比率方面均顯著(P0.05),24 h時血栓黑尾比率為78.45%,該劑量下大鼠腸系膜無病變產(chǎn)生,腹腔內(nèi)無積水,同時血細胞發(fā)生明顯凝集并形成血栓。結(jié)果表明,20 mg/kg角叉菜膠腹腔注射可以建立安全的、貼近臨床研究的血栓模型,為血栓類疾病和新藥研究可提供合格的動物病理模型。2.統(tǒng)計基因表達譜芯片各藥物處理組的差異基因數(shù)目和對差異基因做多重對比的維恩圖分析,發(fā)現(xiàn)中劑量AEE及阿司匹林和丁香酚聯(lián)合用藥組與模型組比較差異表達基因數(shù)目分別為7076和9988,同時與正常組比較差異表達基因數(shù)目分別為7593和8728,是所有藥物組中差異基因數(shù)目最多的;AEE差異表達基因數(shù)目高于阿司匹林和丁香酚。維恩圖對不同藥物處理組進行對比分析發(fā)現(xiàn),中劑量AEE及阿司匹林和丁香酚聯(lián)合用藥組與模型組比較共同差異表達基因數(shù)目為4610,與正常組比較共同差異表達基因數(shù)目為4266,在所有藥物處理組中差異基因數(shù)目最多;所有AEE劑量組共同差異表達基因數(shù)目高于阿司匹林和丁香酚。3.對AEE與其它藥物處理組基因表達譜數(shù)據(jù)進行多重聚類和KEGG Pathway分析篩選信號通路和靶基因,并用qRT-PCR進行驗證分析。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)AEE主要影響蛋白質(zhì)、脂類、炎癥介質(zhì)和離子反應相關(guān)的生物學過程、細胞組分和分子功能發(fā)揮抗血栓作用;KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)AEE主要通過影響補體和凝血級聯(lián)信號通路發(fā)揮其抗血栓作用。對補體和凝血級聯(lián)信號通路分析篩選出5個靶基因,分別是Fga、Fgb、F2、Serpinc1和Plaur基因;qRT-PCR分析5個靶基因,發(fā)現(xiàn)AEE在抗血栓過程中Fga、Fgb、F2和Serpinc1基因下調(diào),Plaur基因上調(diào)與芯片結(jié)果基本一致。結(jié)果表明AEE不僅具有與前體藥物一樣的抗血小板作用,同時還特異性的發(fā)揮其溶栓作用。對血栓形成后引起的細胞癌變與腫瘤有治療作用,在抗血栓治療中達到標本兼治的效果。
【關(guān)鍵詞】：血栓模型 AEE 基因表達譜芯片 差異表達基因 信號通路 qRT-PCR
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R965
【目錄】：

• 摘要2-4
• Summary4-7
• 縮略語表7-13
• 第一章 文獻綜述13-27
• 1.1 凝血和抗凝血機制概述13-19
• 1.1.1 血栓形成研究13-16
• 1.1.1.2 凝集系統(tǒng)13-14
• 1.1.1.3 血小板激活和聚集14-15
• 1.1.1.4 血液流動條件的改變15-16
• 1.1.2 抗凝血研究16-19
• 1.1.2.1 抑制組織因子16
• 1.1.2.2 抑制凝血途徑16
• 1.1.2.3 抗血小板聚集16
• 1.1.2.4 抑制血小板膜受體16-17
• 1.1.2.5 核苷酸系統(tǒng)上的影響17
• 1.1.2.6 抑制血小板顆粒分泌17-18
• 1.1.2.7 影響花生四烯酸系統(tǒng)18
• 1.1.2.8 纖維蛋白溶解18-19
• 1.2 AEE研究概述19-21
• 1.2.1 AEE的藥理學作用19-21
• 1.2.1.1 抗炎作用19-20
• 1.2.1.2 抗血小板凝集作用20
• 1.2.1.3 鎮(zhèn)痛作用20
• 1.3.1.4 解熱作用20
• 1.3.1.5 抗氧化作用20-21
• 1.2.2 毒性研究21
• 1.3 基因芯片研究概述21-24
• 1.3.1 基因芯片的應用22-23
• 1.3.1.1 藥物篩選和新藥開發(fā)22
• 1.3.1.2 疾病診斷22
• 1.3.1.3 環(huán)境保護22-23
• 1.3.2 基因芯片的研究領(lǐng)域23-24
• 1.3.2.1 基因表達檢測23
• 1.3.2.2 尋找新基因23
• 1.3.2.3 DNA測序23-24
• 1.3.2.4 核酸突變的檢測及SNP分析24
• 1.4 研究的目的和意義24-25
• 1.5 技術(shù)路線25-27
• 1.5.1 血栓模型25-26
• 1.5.2 信號通路和靶基因分析26-27
• 第二章 wistar大鼠血栓模型的建立和研究27-34
• 2.1 實驗材料27-28
• 2.1.1 實驗動物27
• 2.1.2 試劑和儀器27-28
• 2.2 實驗方法28-29
• 2.2.1 藥物劑量28
• 2.2.2 腹腔注射28
• 2.2.3 病理學觀察28
• 2.2.4 細胞形態(tài)觀察28-29
• 2.2.5 統(tǒng)計分析29
• 2.3 實驗結(jié)果29-32
• 2.3.1 血栓29
• 2.3.2 血栓黑尾長度分析29-30
• 2.3.3 血栓黑尾比率分析30-31
• 2.3.4 病理學分析31-32
• 2.3.5 血細胞形態(tài)觀察32
• 2.4 討論32-34
• 第三章 心臟組織基因表達譜分析34-48
• 3.1 實驗材料34
• 3.1.1 實驗動物34
• 3.1.2 組織樣品34
• 3.2 實驗試劑與儀器34
• 3.3 實驗方法34-39
• 3.3.1 血栓模型34
• 3.3.2 藥物劑量和分組34-35
• 3.3.3 制備基因表達譜芯片35-38
• 3.3.3.1 Total RNA提取35-36
• 3.3.3.2 Total RNA的純化36
• 3.3.3.3 RNA濃度測定36
• 3.3.3.4 cDNA合成36-37
• 3.3.3.5 cDNA熒光標記37
• 3.3.3.6 cDNA樣品片段化37-38
• 3.3.3.7 芯片雜交和洗滌38
• 3.3.3.8 芯片掃描38
• 3.3.4 芯片生物信息學分析38-39
• 3.3.4.1 差異基因篩選和分析38
• 3.3.4.2 維恩圖分析38-39
• 3.4 實驗結(jié)果39-46
• 3.4.1 血栓形成39
• 3.4.2 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果39-40
• 3.4.3 心臟組織基因表達譜芯片檢測結(jié)果40-43
• 3.4.3.1 治療組與正常組基因表達譜結(jié)果分析40-41
• 3.4.3.2 治療組與模型組基因表達譜結(jié)果分析41-42
• 3.4.3.3 治療組與CMC-Na藥物溶劑組基因表達譜結(jié)果分析42
• 3.4.3.4 CMC-Na藥物溶劑基因表達圖結(jié)果分析42-43
• 3.4.3.5 模型組和正常組基因表達譜結(jié)果分析43
• 3.4.4 藥物抗血栓作用的相關(guān)性分析43-46
• 3.4.4.1AEE對血栓基因表達的影響43
• 3.4.4.2 AEE、阿司匹林和丁香酚對血栓基因表達的影響43-44
• 3.4.4.3 AEE、阿司匹林和丁香酚與聯(lián)合用藥對血栓基因表達的影響44-46
• 3.5 討論46-48
• 第四章 AEE抗血栓作用信號通路和靶基因分析48-81
• 4.1 實驗材料48
• 4.1.1 動物材料48
• 4.1.2 軟件及數(shù)據(jù)庫48
• 4.2 試劑和儀器48
• 4.3 實驗方法48-51
• 4.3.1 表達差異基因的篩選和分析48
• 4.3.2 qRT-PCR分析48-51
• 4.3.2.1 Total RNA的提取49
• 4.3.2.2 mRNA的檢測和分析49-50
• 4.3.2.3 引物的設計與合成50
• 4.3.2.4 Total RNA的反轉(zhuǎn)錄反應50-51
• 4.3.2.5 qRT-PCR反應51
• 4.3.2.6 統(tǒng)計分析51
• 4.4 實驗結(jié)果51-77
• 4.4.1 mRNA凝膠電泳分析51-52
• 4.4.2 大鼠基因表達譜芯片分析52-73
• 4.4.2.1 細胞組分分析52-57
• 4.4.2.2 生物學過程分析57-63
• 4.4.2.3 分子功能分析63-67
• 4.4.2.4 差異表達基因Pathway分析67-72
• 4.4.2.5 凝血級聯(lián)信號通路和靶基因72-73
• 4.4.3 qRT-PCR分析73-77
• 4.5 討論77-81
• 4.5.1 AEE抗血栓作用的基因表達譜分析77-78
• 4.5.2 Fga和Fgb基因研究78
• 4.5.3 Serpinc1基因研究78-79
• 4.5.4 Plaur基因研究79
• 4.5.5 F2基因研究79-81
• 第五章 結(jié)論81-82
• 參考文獻82-92
• 致謝92-93
• 作者簡介93-94
• 導師簡介94-96

【參考文獻】

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本文編號：304455