本文關鍵詞：1.免疫無應答HIV患者血漿中雷公藤3個單體成分藥物濃度及其與異常免疫激活關系初探 2.高效液相色譜法測定血清、腦脊液及胰液中利奈唑胺藥物濃度，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景自20世紀90年代開始應用高效抗反轉錄病毒治療(highly-active antiretroviral treatment, HAART)以來,艾滋病(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的治療取得了突破性的進展。HAART可以有效抑制人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的復制,使HIV患者CD4+T細胞逐漸恢復至正常,從而達到免疫功能重建。臨床觀察發(fā)現(xiàn)約有20% HIV患者經(jīng)過長期]HAART治療,病毒復制被有效抑制,但CD4+T細胞計數(shù)卻未能恢復至最佳水平,仍然表現(xiàn)為免疫無應答,這類患者被稱為免疫無應答者(immunologic non-responders, INRs)。免疫無應答導致患者機會性感染、腫瘤、心血管疾病、肝臟疾病等的發(fā)病率和病死率顯著升高。鑒于此,尋找高效低毒的藥物治療免疫無應答HIV患者已成為重大課題。在免疫無應答的各種影響因素中,異常免疫激活占據(jù)主導地位[2]。雷公藤為中國的傳統(tǒng)中藥,已有幾百年的歷史,藥理學研究表明其具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等作用,臨床上廣泛用于自身免疫性疾病、類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)、皮膚病等的治療,并收到預期的良好效果,號稱“中藥皮質激素”。對雷公藤部分單體成分體外及動物體內藥理學研究表明,雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內酯酮、去甲澤拉木醛、雷醇內酯等具有顯著的抗炎和免疫抑制活性。北京協(xié)和醫(yī)院感染科對免疫無應答HIV患者(n=19)高效抗反轉錄病毒治療加用雷公藤多苷片的預實驗也初步證實了雷公藤多苷片對恢復免疫無應答HIV患者免疫功能的作用。遺憾的是,上市的雷公藤制劑主要是雷公藤片、雷公藤多苷片及昆明山海棠片,均為復方制劑,含數(shù)十個單體成分。能使免疫無應答HIV患者恢復免疫功能的單體成分是什么?其作用機制又是什么?為初步回答上述2個問題,本研究選擇雷公藤紅素、雷公藤甲素、雷醇內酯為研究對象,試圖初步考察上述3個單體是否為使免疫無應答HIV患者CD4+T細胞計數(shù)恢復至正常水平的單體成分；進一步考察上述3個單體是否能通過抑制CD38、HLA-DR免疫激活分子抑制細胞免疫激活。研究目的本研究分別建立測定雷公藤紅素、雷公藤甲素和雷醇內酯的超高液相色譜串聯(lián)質譜 (ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric,UPLC-MS/MS)方法,測定健康受試者和免疫無應答HIV患者口服雷公藤多苷片后雷公藤紅素、雷公藤甲素、雷醇內酯的血藥濃度,Winnonlin 1.5非房室模型計算3個單體在健康受試者中的藥代動力學參數(shù)。同時探究HIV患者中3個單體血藥濃度與所測定的CD4+T細胞計數(shù)增長率,CD4+T細胞計數(shù)增長量及免疫激活指標CD38(%)和HLA-DR(%)改變量的相關性。旨在發(fā)現(xiàn)恢復免疫不應答HIV患者免疫功能的可能單體成分及其作用機制,促進單體藥物的基礎研究和研發(fā),為雷公藤的臨床廣泛使用提供參考。研究對象與方法首先建立測定人血漿中雷公藤紅素、雷公藤甲素和雷醇內酯藥物濃度的UPLC-MS/MS方法。測定雷公藤多苷片中雷公藤3個單體含量。健康受試者單劑量口服雷公藤多苷片20 mg后0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h采集血漿樣本,測定血藥濃度,Winnonlin 1.5非房室模型計算藥代動力學參數(shù)。免疫無應答HIV患者(n=19)多劑量口服雷公藤多苷片10 mg或20 mg,tid,采集谷濃度血漿樣本,應用UPLC-MS/MS方法測定血漿中雷公藤紅素、雷公藤甲素、雷醇內酯的藥物濃度,應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析免疫無應答HIV患者血漿中雷公藤3個單體藥物濃度與患者CD4+T細胞計數(shù)增長率、CD4+T細胞計數(shù)增長量、免疫激活指標CD38(%)和HLA-DR(%)改變量之間的相關性。研究結果建立了電噴霧正離子(electronic spray ion with positive ionization ions, ESI+)、多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)模式測定雷公藤紅素的UPLC-MS/MS方法,建立了ESI+、MRM模式同時測定雷公藤甲素和雷醇內酯的UPLC-MS/MS方法。雷公藤多苷片中雷公藤紅素、雷公藤甲素和雷醇內酯平均含量分別為22.941(15.163～31.755)μg/片、7.649(3.598～14.495)ng/片和1423.475(817.895～2233.433)ng/片。健康受試者單劑量口服雷公藤多苷片20 mg,對血藥濃度測定值進行非房室模型分析顯示,血漿中雷公藤紅素峰濃度Cmax為0.52ng·mL-1,達峰時間Tmax為3.0 h,半衰期t1/2為16.76 h；所有時間點雷公藤甲素和雷醇內酯的血藥濃度均低于最低定量限(the lowest limit of quantification, LLOQ)。HIV患者(n=19)多劑量口服雷公藤多苷片10 mg或20 mg, tid,血漿中雷公藤紅素濃度為(0.28-4.01) ng·mL-1,血漿中雷公藤甲素和雷醇內酯濃度均低于LLOQ。SPSS統(tǒng)計分析結果：對HIV患者雷公藤紅素血藥濃度、CD4+T細胞計數(shù)增長率、CD4+T細胞計數(shù)增長量、CD38(%)和HLA-DR(%)改變量進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗,p0.05,均符合正態(tài)分布。對CD4+T細胞計數(shù)增長率、CD4+T細胞計數(shù)增長量、CD38(%)和HLA-DR(%)玫變量與雷公藤紅素血藥濃度進行Pearson相關性分析,相關系數(shù)分別為0.072、-0.211、0.310、0.424,相關性假設檢驗p值分別為0.798、0.445、0.261、0.116,均0.05,均未見統(tǒng)計學相關性。按不同劑量20 mg,tid組和10 mg, tid組分組分析,對兩組血藥濃度、CD4+T細胞計數(shù)增長率、CD4+T細胞計數(shù)增長量、CD38(%)和HLA-DR(%)改變量進行獨立樣本T檢驗,結果均未見統(tǒng)計學差異。根據(jù)CD4+T細胞計數(shù)增長率分組比較兩組血藥濃度差異,兩組血藥濃度統(tǒng)計學上未見顯著差異。研究結論研究結果顯示雷公藤紅素與CD4+T細胞計數(shù)增長率、CD4+T細胞計數(shù)增長量、CD38(%)和HLA-DR(%)改變量統(tǒng)計學上不具有相關性。不同劑量組,上述指標統(tǒng)計學上未見顯著差異。因本研究混雜因素較多,樣本量較少,尚不能證實雷公藤紅素是否為恢復免疫無應答HIV患者免疫功能的雷公藤單體成分。雷公藤甲素和雷醇內酯因血漿藥物濃度低于LLOQ,未能分析其與免疫無應答HIV患者免疫重建的關系。研究背景革蘭氏陽性球菌(Gram-positive bacterial, G+)是社區(qū)和醫(yī)院感染的重要病原菌,其中較為常見的有金黃色葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌等。G+菌進入血液循環(huán)或腦組織,引起菌血癥、敗血癥或顱內感染,患者預后較差。近年來,隨著抗生素廣泛應用,細菌耐藥情況日趨嚴重。對耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)等陽性菌敏感的萬古霉素等抗G+菌的抗菌藥物敏感性也逐漸下降。利奈唑胺以其廣譜強效的抗G+菌活性,良好的脂溶性和組織穿透率等特征著稱,且不導致腎臟毒性。目前,國內外尚無利奈唑胺在胰腺組織中的穿透性及藥代動力學研究。此外,國內尚無利奈唑胺在重癥感染患者及多藥耐藥患者中藥代動力學和藥效動力學的研究。鑒于此,建立測定血清、腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)和胰液(pancreatic juice, PJ)中利奈唑胺濃度的方法學,為進一步研究利奈唑胺在胰腺組織的穿透性、在中國重癥感染患者、多藥耐藥患者中藥代動力學-藥效動力學特征提供方法學基礎,為臨床合理使用該藥提供參考。研究目的建立同時測定人血清、腦脊液、胰液中利奈唑胺藥物濃度的高效液相色譜(high-performance liquid chromatographic, HPLC)方法學。研究方法以利培酮為內標物,在0.1 mol·L-1 NaOH堿性條件下甲基叔丁基醚：正丙醇=90：10(v/v)液液提取,Shima-pack CLC-ODS-C18 (150 mm × 6.0 mm,5 μm)色譜柱分離,流動相為甲醇：乙腈：磷酸緩沖溶液(0.02 mol·L1 KH2PO4, H3PO4調pH=3.5)=20: 16:64 (v/v/v),流速1.0 mL·min-1,柱溫35℃,檢測波長254 nm條件下測定。研究結果血清中利奈唑胺在(0.25～40.0)mg·L-1內線性良好(r=0.999),定量限為0.25mg.L-1,低、中、高(0.8、8.0、25.0 mg·L-1)3個濃度質控樣本的批內相對標準誤差(RSD)為1.64%～2.38%(n=5),批間RSD為4.53%～6.34%(n=5),方法學回收率為93.781%～97.393%(n=5),提取回收率為72.861%～77.539%(n=5)；腦脊液中利奈唑胺在(0.1～20.0)mg·L-1內線性良好(r=0.999),定量限為0.1 mg·L-1,低、中、高(0.2、2.0、15.0 mg·L-1)3個濃度質控樣本的批內RSD為3.84%～4.83%(n=5),批間RSD為6.04%～8.16%(n=5),方法學回收率為106.910%～110.971%(n=5)提取回收率為73.226%～79.754%(n=5)；胰液中利奈唑胺在(0.1～20.0)mg·L-1內線性良好(r=0.999),定量限為0.1 mg·L-1,低、中、高(0.2、2.0、15.0 mg·L-1)3個濃度質控樣本的批內RSD為2.96%～5.30%(n=5),批間RSD為4.68%～6.40%(n=5),方法學回收率為97.178%-105.072%(n=5),提取回收率73.333%～76.010%(n=5)。內標提取回收率87%。研究結論本方法靈敏度高,準確性好,簡便快捷,應用液液提取處理樣本去除更多雜峰于擾,更廣泛適用于臨床,適用于多種合并用藥患者生物標本中利奈唑胺藥物濃度的測定。
【關鍵詞】：雷公藤紅素 雷公藤甲素 雷醇內酯 藥代動力學 免疫無應答 HIV患者 CD4~+T細胞計數(shù) CD38(%) HLA-DR(%) 利奈唑胺 血清藥物濃度 腦脊液藥物濃度 胰液藥物濃度 高相液相色譜法
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R969.1
【目錄】：

• 第一部分 免疫無應答HIV患者血漿中雷公藤3個單體成分藥物濃度及其與異常免疫激活關系初探5-90
• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 第一節(jié) 建立測定人血漿中雷公藤紅素的UPLC-MS/MS方法14-26
• 摘要14
• ABSTRACT14-15
• 1 儀器與試藥15-16
• 2 方法16-20
• 3 結果20-23
• 4 討論23-25
• 5 小結25-26
• 第二節(jié) 建立同時測定人血漿中雷公藤甲素和雷醇內酯UPLC-MS/MS方法26-39
• 摘要26
• ABSTRACT26-27
• 1 儀器與試藥27-28
• 2 方法28-31
• 3 結果31-35
• 4 討論35-38
• 5 小結38-39
• 第三節(jié) UPLC-MS/MS測定雷公藤多苷片中雷公藤3個單體含量均勻度39-47
• 摘要39
• ABSTRACT39-40
• 1 儀器與試藥40
• 2 方法40-43
• 3 結果43-45
• 4 討論45-46
• 5 小結46-47
• 第四節(jié) 健康受試者體內雷公藤3個單體藥代動力學初探47-54
• 摘要47
• ABSTRACT47-48
• 1 儀器與試藥48
• 2 方法48-49
• 3 結果49-50
• 4 討論50-53
• 5 小結53-54
• 第五節(jié) 免疫無應答HIV患者血漿中雷公藤3個單體藥物濃度與異常免疫激活關系探討54-67
• 摘要54
• ABSTRACT54-56
• 1 儀器與試劑56
• 2 方法56-58
• 3 結果58-64
• 4 討論64-66
• 5 小結66-67
• 參考文獻67-71
• 總結71-73
• 論文相關綜述一 雷公藤抗炎免疫調節(jié)活性單體的研究發(fā)展73-79
• 參考文獻76-79
• 論文相關綜述二 雷公藤抗HIV活性及其研究中的機遇和挑戰(zhàn)79-90
• 參考文獻86-90
• 第二部分 高效液相色譜法測定人血清、腦脊液和胰液中利奈唑胺藥物濃度90-127
• 英文縮略詞表90-91
• 中文摘要91-93
• ABSTRACT93-95
• 第一節(jié) 高效液相色譜法測定人血清、腦脊液和胰液中利奈唑胺濃度95-112
• 1 儀器與試藥95-96
• 2 方法96-99
• 3 結果99-106
• 4 討論106-111
• 5 小結111-112
• 第二節(jié) 利奈唑胺臨床藥效學初探112-117
• 摘要112
• ABSTRACT112
• 1 儀器與試藥112
• 2 方法112-113
• 3 結果113-115
• 4 討論115-116
• 5 小結116-117
• 參考文獻117-119
• 總結119-120
• 論文相關綜述 利奈唑胺組織穿透性及在感染組織中的藥效學120-127
• 參考文獻125-127
• 附錄一 研究生期間發(fā)表的文章題錄127-128
• 附錄二 致謝128-129

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關鍵詞：1.免疫無應答HIV患者血漿中雷公藤3個單體成分藥物濃度及其與異常免疫激活關系初探 2.高效液相色譜法測定血清、腦脊液及胰液中利奈唑胺藥物濃度，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：287735