本文選題：衍生化　切入點(diǎn)：芥子氣　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年碩士論文

【摘要】：芥子氣(sulfur mustard,SM)是典型的雙功能烷烴化試劑,也是難防難治的糜爛性化學(xué)戰(zhàn)劑的代表,被稱作 毒劑之王‖。SM是日本遺棄在我國(guó)的化學(xué)武器的主要填充劑,對(duì)遺留地人民的安全以及環(huán)境造成了重大威脅,同時(shí)由于SM具有制備工藝簡(jiǎn)單,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,存儲(chǔ)簡(jiǎn)便,防護(hù)困難和殺傷力大等特點(diǎn),其仍然具有潛在的恐怖威脅,因此關(guān)于SM代謝途徑及中毒機(jī)制的研究一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。SM具有強(qiáng)烷基化活性,進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)與體內(nèi)的小分子及生物大分子的親核性基團(tuán)發(fā)生廣泛的烷基化反應(yīng)而導(dǎo)致某些生物功能受損。從化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果看,SM進(jìn)入體內(nèi)后主要經(jīng)歷水解、氧化、谷胱甘肽結(jié)合和β裂解,以及與DNA和蛋白質(zhì)等大分子加合的代謝途徑。目前關(guān)于SM代謝的研究報(bào)道集中在SM的水解產(chǎn)物硫二甘醇(TDG)及硫二甘醇亞砜(TDGO),β裂解產(chǎn)物(SBMSE)以及蛋白加合物,而關(guān)于SM在體內(nèi)的氧化途徑以及氧化產(chǎn)物的研究報(bào)道卻較少。有文獻(xiàn)報(bào)道SM的氧化產(chǎn)物芥子亞砜(SMO)芥子砜(SMO2)仍然具有烷基化功能,對(duì)機(jī)體有毒性損傷作用,SM在體內(nèi)氧化代謝生成氧化產(chǎn)物會(huì)對(duì)機(jī)體造成進(jìn)一步的毒性損傷,但一直缺少直接的數(shù)據(jù)證明SM在體內(nèi)會(huì)發(fā)生氧化代謝過程�；诖�,本課題組進(jìn)行了關(guān)于SM體內(nèi)代謝的研究,應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)直接檢測(cè)SM在血漿中的代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)SMO是SM進(jìn)入體內(nèi)后血循環(huán)中的主要代謝產(chǎn)物,但由于SMO2活性較強(qiáng),不適宜直接LC-MS/MS的直接檢測(cè),故SM進(jìn)入體內(nèi)后是否會(huì)繼續(xù)氧化生成毒性氧化產(chǎn)物SMO2仍然缺少直接的數(shù)據(jù)支持。同時(shí)研究芥子氣代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),芥子氣谷胱甘肽途徑的代謝產(chǎn)物具有砜類氧化產(chǎn)物的特征結(jié)構(gòu),芥子氣的氧化產(chǎn)物是否參與了芥子氣的谷胱甘肽途徑也需要進(jìn)一步研究。本研究依托現(xiàn)代儀器分析技術(shù)和分析毒理學(xué)研究方法,以SM的氧化代謝過程為研究對(duì)象。通過分析SM,SMO和SMO2在體內(nèi)的含量變化趨勢(shì),實(shí)現(xiàn)對(duì)SM的氧化代謝過程的監(jiān)測(cè),從而定量描述了SM的氧化代謝過程。同時(shí)本研究通過定向篩查的策略進(jìn)一步研究了SM代謝的新途徑。本研究的結(jié)果不僅為SM的代謝研究提供了新的檢測(cè)技術(shù),且進(jìn)一步完善了SM的體內(nèi)代謝過程,發(fā)現(xiàn)了氧化產(chǎn)物的可能毒性作用機(jī)制,和SM代謝的新途徑。為了解決體內(nèi)SM及其氧化產(chǎn)物難以同時(shí)檢測(cè)的難點(diǎn),本論文中利用SM及其氧化產(chǎn)物的烷基化活性,應(yīng)用衍生化策略將三者轉(zhuǎn)化為適用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)的穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物,從而建立了生物基質(zhì)中SM及其氧化產(chǎn)物同時(shí)檢測(cè)的LC-MS/MS方法。并對(duì)包括衍生化試劑濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、ph值等在內(nèi)的衍生化條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化使衍生化效率達(dá)到最佳。優(yōu)化后的方法步驟簡(jiǎn)單方便操作,從樣品采集到進(jìn)樣分析可在90min內(nèi)完成。同時(shí)對(duì)所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)考察,結(jié)果顯示該方法在所考察的濃度范圍內(nèi)線性良好,定量限為0.2 1μg/l,絕對(duì)回收率在68%-92%,基質(zhì)效應(yīng)在75% 108%,準(zhǔn)確度和精密度均滿足生物樣品分析檢測(cè)的要求。本研究方法的建立為實(shí)際樣品的檢測(cè)以及sm氧化代謝過程的研究提供了方法基礎(chǔ)。針對(duì)芥子氣皮膚染毒大鼠模型,應(yīng)用所建立的定量檢測(cè)方法對(duì)芥子氣在血中的氧化代謝行為進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果顯示染毒后第一個(gè)采樣點(diǎn)5min時(shí)血中可以同時(shí)檢出芥子氣,芥子亞砜和芥子砜,其中芥子氣的檢測(cè)時(shí)間窗為染毒后5min-6h,芥子氣的氧化產(chǎn)物芥子亞砜及芥子砜的檢測(cè)時(shí)間窗均為5min-9h,說(shuō)明芥子氣進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)立即發(fā)生氧化代謝過程。sm皮膚染毒后血中smo2的量與sm相當(dāng),芥子氣皮膚染毒后血中smo的峰值濃度(cmax)為3143.9±68.0μg/l,顯著高于其他代謝產(chǎn)物,表明芥子氣進(jìn)入體內(nèi)后smo是其主要的代謝產(chǎn)物,揭示了氧化途徑是芥子氣主要的代謝途徑之一。為了進(jìn)一步研究芥子氣的氧化代謝過程,對(duì)芥子亞砜靜脈染毒大鼠代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)血中可以檢出芥子砜,說(shuō)明芥子亞砜可以繼續(xù)氧化生成芥子砜,該研究結(jié)果完善了芥子氣的體內(nèi)氧化過程。通過研究芥子氣染毒后芥子氣及其氧化產(chǎn)物的代謝動(dòng)力學(xué)行為發(fā)現(xiàn)芥子氣氧化產(chǎn)物smo及smo2的達(dá)峰時(shí)間(smo:3.0±0.0h;smo2:2.6±0.5h)顯著滯后于芥子氣(0.5±0.09h),表明了芥子氣在體內(nèi)氧化代謝生成氧化產(chǎn)物的過程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)芥子砜的平均駐留時(shí)間(mrt)為5.3±0.4h,顯著長(zhǎng)于sm及smo的mrt(sm:1.5±0.2h;smo:3.7±0.1h),且前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)體內(nèi)高濃度的芥子亞砜會(huì)不斷氧化生成芥子砜,結(jié)合芥子砜的毒性數(shù)據(jù)(ld50:50mg/kg),認(rèn)為芥子砜在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間的存在可能對(duì)機(jī)體造成進(jìn)一步損傷。為了進(jìn)一步研究芥子氣的代謝新途徑以及芥子氣氧化產(chǎn)物對(duì)芥子氣毒性作用的貢獻(xiàn),結(jié)合前人的工作以較穩(wěn)定的二乙烯砜(dvs)作為芥子氣氧化產(chǎn)物的代表,在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平來(lái)發(fā)現(xiàn)和確證芥子氣氧化產(chǎn)物與谷胱甘肽的加合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芥子氣及芥子氣氧化產(chǎn)物在體內(nèi)均會(huì)生成谷胱甘肽加合物,根據(jù)加合物的結(jié)構(gòu)特征推測(cè)體內(nèi)sm的谷胱甘肽解毒途徑不僅包括目前普遍認(rèn)可的先結(jié)合再氧化途徑,同時(shí)也存在被忽視了的先氧化成砜再與谷胱甘肽結(jié)合(并β裂解)的代謝過程。此結(jié)果表明芥子氣的氧化產(chǎn)物也會(huì)參與芥子氣的谷胱甘肽解毒途徑,是芥子氣谷胱甘肽途徑的另一條通路。同時(shí)由于谷胱甘肽耗竭也是芥子氣損傷的重要機(jī)制之一,故認(rèn)為芥子氣的氧化產(chǎn)物通過與谷胱甘肽加合而發(fā)揮毒性作用。本論文的創(chuàng)新點(diǎn)及新發(fā)現(xiàn):1)通過衍生化策略首次建立了生物基質(zhì)中SM及其氧化產(chǎn)物的定量檢測(cè)新方法,該方法可以同時(shí)檢測(cè)生物基質(zhì)中的SM及其氧化產(chǎn)物,為SM的氧化代謝研究提供了有力的工具。2)通過SM染毒后血液中SM及其氧化產(chǎn)物的時(shí)效關(guān)系及代謝動(dòng)力學(xué)研究,揭示了SM進(jìn)入體內(nèi)后的氧化代謝過程,同時(shí)發(fā)現(xiàn)單氧化產(chǎn)物SMO是SM中毒后血循環(huán)中的主要代謝產(chǎn)物,也是SM的重要生物標(biāo)志物。并首次在血液中檢出SM的毒性氧化產(chǎn)物芥子砜,為SM的代謝途徑及損傷機(jī)制研究提供了新思路。3)通過分析芥子氣及其氧化產(chǎn)物和谷胱甘肽的活性位點(diǎn),同時(shí)結(jié)合β裂解產(chǎn)物的特征性結(jié)構(gòu),推測(cè)并在體內(nèi)鑒定出SM谷胱甘肽加合物以及DVS谷胱甘肽加合物。并研究了芥子氣氧化產(chǎn)物在體內(nèi)的代謝行為,發(fā)現(xiàn)芥子氣氧化產(chǎn)物通過谷胱甘肽結(jié)合發(fā)揮毒性作用并進(jìn)一步代謝,同時(shí)完善了SM體內(nèi)代謝的新途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R82

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