本文選題：模擬微重力　切入點(diǎn)：航天飛行后心血管失調(diào)　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 航天失重環(huán)境可導(dǎo)致機(jī)體心血管系統(tǒng)由于重力的消失產(chǎn)生異常,即使宇航員暴露于失重環(huán)境的時(shí)間十分短暫,心血管系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生一系列適應(yīng)性變化,并將直接影響宇航員身體健康,嚴(yán)重時(shí)會(huì)威脅飛行安全。這些由于失重誘發(fā)的心血管系統(tǒng)適應(yīng)性改變的綜合癥被稱作心血管失調(diào)(Cardiovascular deconditioning, CD),表現(xiàn)以立位不耐受,心悸,暈厥為主,然而目前關(guān)于CD產(chǎn)生機(jī)制的闡釋仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠明確。內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液與血管組織之間天然的解剖屏障,而且是血管活性器官。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有選擇通透性、抗血栓、調(diào)節(jié)血管緊張度、促進(jìn)毛細(xì)血管形成以及產(chǎn)生血細(xì)胞粘接因子等功能,而且還是多種血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子以及生長因子的來源和靶器官,血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與多種心血管功能失調(diào)有密切的關(guān)系。 近年來,地面模擬研究證實(shí)-6°頭低位臥床受試者血液中可檢測到凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞;同時(shí),另有學(xué)者在尾部懸吊后肢卸荷模型大鼠的血管組織中檢測到高表達(dá)的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase, iNOS),提示模擬失重可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生多種異常。本研究采用地面二維回轉(zhuǎn)培養(yǎng)器(2D- clinostat)模擬細(xì)胞在空間中的受力狀態(tài),以地面正常1g重力(Normal gravity, NG)作對照,對模擬微重力(Modeled microgravity, MMG)干預(yù)后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)的形態(tài)與功能進(jìn)行多角度評(píng)價(jià),為明確內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是介導(dǎo)CD產(chǎn)生的重要機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。大量臨床與實(shí)驗(yàn)室研究提示:活血化瘀類中藥對血管內(nèi)皮細(xì)胞有明確的保護(hù)作用并能通過調(diào)節(jié)其分泌血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管功能。研究表明,紅花甙(Carthamin)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷并改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。因此,本研究在明確MMG導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)上,將進(jìn)一步采用Carthamin對MMG作用下HUVECs進(jìn)行干預(yù),觀察其逆轉(zhuǎn)與修復(fù)效應(yīng),為失重致CD的藥物防護(hù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)一MMG導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞骨架重構(gòu)及其對細(xì)胞增殖、遷移的影響 目的:觀察MMG致HUVECs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)(纖維狀肌動(dòng)蛋白和微管)的改變,并對MMG作用后細(xì)胞的增殖、遷移等功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法:酶消化法原代培養(yǎng)HUVECs,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行鑒定,取3～5代的HUVECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為2D- clinostat干預(yù)的MMG培養(yǎng)組與NG對照培養(yǎng)組,均培養(yǎng)48 h;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期變化;Transwell觀察細(xì)胞遷移情況;免疫熒光及激光共聚焦觀察HUVECs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。 結(jié)果:①HUVECs的培養(yǎng)與鑒定:所培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定,其CD31與Ⅷ因子為表達(dá)較高。②HUVECs骨架觀察結(jié)果:NG對照組的纖維狀肌動(dòng)蛋白(fibers actin, f-actin)為束狀、放射狀,其方向感明顯,且呈現(xiàn)出具有較多偽足的纖維骨架結(jié)構(gòu);然而MMG作用48 h后,盡管f-actin沒有發(fā)生明顯的崩解但是其方向感明顯消失,并且f-actin的束狀纖維也大部分消失;MMG干預(yù)48 h使大量的微管蛋白發(fā)生解聚,微管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)模糊不見,隨之代替的是崩解的微管小聚體。③細(xì)胞增殖及凋亡檢測:MMG可使HUVECs增殖明顯抑制,細(xì)胞周期抑制于G2/M期(G2/M:MMG, 27.6%, NG, 18.1%;P0.05),然而細(xì)胞并沒有發(fā)生明顯凋亡。④細(xì)胞遷移檢測:MMG干預(yù)可使HUVECs的遷移受到抑制,抑制率為-62.7% (P0.05)。 結(jié)論:MMG可顯著影響HUVECs的形態(tài)與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)并抑制其增殖與遷移功能,HUVECs的增殖抑制可能與紊亂的微管結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。 實(shí)驗(yàn)二MMG對HUVECs的FAs形成、定位以及FAs功能的影響 目的:對MMG干預(yù)下HUVECs的FAs多種參數(shù)進(jìn)行半定量觀測,并對FAs的酪氨酸活化水平進(jìn)行評(píng)價(jià),進(jìn)一步檢測其中關(guān)鍵蛋白激酶和FAs中酪氨酸激酶的主要受體integrins的表達(dá)。 方法:激光共聚焦結(jié)合高通量激光半定量計(jì)算方法,對FAs的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),其參數(shù)包括FAs平均數(shù)量(mean vinculin spot number per cell, VN);FAs平均面積(mean vinculin spot area, VA);FAs平均交疊面積(the area percentage of overlap of FAs, OSP);FAs平均到細(xì)胞邊緣距離(average distance of vinculin spots from the cell edge, DS)。免疫熒光觀察酪氨酸磷酸化(Tyrosine phosphorylation , PTyr)水平,Western blot檢測FAK,pyk2,ILK的總表達(dá)量與磷酸化表達(dá)量,Western blot以及RT-PCR檢測integrinβ1和β4的表達(dá)。 結(jié)果:①FAs形態(tài)學(xué)改變:FAs在MMG干預(yù)下,形成的數(shù)量(VN)與面積(VA)明顯減少,VN較NG對照組減少-50.6% (P0.05),VA較NG對照組減少-60.2% (P0.05),FAs定位指標(biāo)DS也不同于NG對照組-28.3%(P0.05)。②PTyr水平檢測:MMG干預(yù)后,FAs的PTyr活化水平明顯抑制(-71.3%)(P0.01)。③FAs激酶活性:MMG影響后FAK,pyk2,ILK總蛋白表達(dá)沒有明顯改變,然而其磷酸化水平明顯下調(diào),FAK,pyk2,ILK下調(diào)量分別為:-27.2%,-30.8%,-36.5% (P0.05)。④integrins結(jié)果:MMG可導(dǎo)致integrinβ1和β4在mRNA與蛋白水平表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論:MMG可影響HUVECs的FAs的生成以及定位,并且其與integrins相關(guān)的酪氨酸活化功能及核心激酶磷酸化水平也明顯下調(diào)。 實(shí)驗(yàn)三Carthamin干預(yù)MMG條件下HUVECs形態(tài)和功能的實(shí)驗(yàn)研究 目的:觀察Carthamin對MMG作用后HUVECs的增殖、遷移以及細(xì)胞骨架的影響。 方法:MMT摸索Carthamin作用最佳濃度,2D- clinostat進(jìn)行失重模擬培養(yǎng)HUVECs,實(shí)行分組如下:NG對照組,MMG對照組,Carthamin+MMG組。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞增殖,Transwell檢測細(xì)胞遷移;觀察Carthamin干預(yù)后細(xì)胞骨架蛋白的改變情況。 結(jié)果:①給藥濃度:Carthamin的最佳給藥濃度為10μg/ml。②細(xì)胞增殖檢測:MMG可使HUVECs增殖明顯抑制,然而Carthamin的干預(yù)并沒有逆轉(zhuǎn)MMG導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞增殖抑制的情況。③細(xì)胞遷移檢測: Carthaminl孵育48 h后,MMG組的遷移情況明顯改善,MMG+Carthamin組較MMG對照組遷移細(xì)胞數(shù)增加了38%(P0.05)。④細(xì)胞骨架結(jié)果:Carthamin干預(yù)后,盡管彌散情況沒有明顯改善,但我們可觀察到細(xì)胞的偽足較MMG對照組增多,微管改善不明顯,MMG+ Carthamin組仍然顯示為彌散的數(shù)個(gè)微管亞聚體。 結(jié)論: Carthamin可明顯改善由于MMG作用而導(dǎo)致的HUVECs細(xì)胞遷移抑制,并修復(fù)由于MMG作用導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞骨架f-actin的骨架重排現(xiàn)象。 實(shí)驗(yàn)四基于FAs以及RhoA對Carthamin修復(fù)MMG致HUVECs遷移抑制分子機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究 目的:觀察Carthamin對MMG條件下HUVECs的FAs的影響,以及基于RhoA初步探討了其在介導(dǎo)Carthamin修復(fù)MMG致HUVECs遷移抑制的分子機(jī)制。 方法:2D- clinostat進(jìn)行失重模擬培養(yǎng)HUVECs,Carthamin干預(yù)后檢測FAs的VA, VN及DS的變化;Exoenzyme C3 Transferase抑制RhoA活性后,檢測FAs的PTyr活化情況以及下游蛋白ILK、Cofilin的磷酸化水平。 結(jié)果:①FAs形態(tài)學(xué)結(jié)果:Carthamin可顯著改善由于MMG導(dǎo)致HUVECs的FAs的形態(tài)學(xué)變化,采用10μg/ml的Carthamin干預(yù)處理后,MMG+Carthamin組的FAs的數(shù)量與面積較MMG對照組均明顯增加,其中VN增加30.3%(P0.05),VA增加25.8%(P0.05);進(jìn)一步對FAs的DS進(jìn)行分析,較MMG對照組MMG+Carthamin組的DS升高了36.4%。(P0.05)。②RhoA阻斷遷移結(jié)果:Exoenzyme C3干預(yù)RhoA活性后,Carthamin的修復(fù)效應(yīng)即被阻斷,其遷移細(xì)胞數(shù)與阻斷前比下降33.3%(P0.05),阻斷后的HUVECs的遷移能力與MMG對照組沒有明顯差異。③RhoA阻斷PTyr以及ILK、Cofilin的磷酸化水平:行Exoenzyme C3干預(yù)后,FAs的PTyr活化水平大幅降低了57.1%(P0.05),此時(shí)PTyr活性與MMG對照組相比沒有明顯差異;同時(shí)RhoA的阻斷影響了其下游ILK、Cofilin的磷酸化水平,它們也分別下降了41.6%與64.3%。 結(jié)論:Carthamin可能通過對FAs的影響以及上調(diào)其激酶活性促進(jìn)MMG條件下HUVECs細(xì)胞遷移的,并且該作用可能與RhoA信號(hào)分子密切相關(guān)。
[Abstract]:Vascular endothelial cells are not only a natural anatomical barrier between blood and vascular tissue , but also a blood vessel active organ . These factors are not only the natural anatomical barrier between blood and vascular tissue , but also the vascular active organs .


In recent years , the study of surface simulation confirmed that apoptotic endothelial cells could be detected in the blood of 6 擄 head low - position bed - bed subjects .


Effects of Experimental One MMG on Cytoskeleton Reconstruction and Its Effects on Cell Proliferation and Migration


Objective : To observe the changes of the cytoskeletal structure ( fibrous actin and microtubules ) induced by MMG and evaluate the proliferation , migration and other functions of the cells after MMG .


Methods : The cells were cultured with enzyme digestion method in primary culture and cultured with flow cytometry ( FCM ) . The cells were randomly divided into two groups : MMG culture group and NG control culture group , which were randomly divided into 2D - clinostat intervention group and NG control culture group . The cell morphology , cell count and flow cytometry were randomly divided into two groups : cell morphology , cell count and flow cytometry analysis .


Results : 鈶，

本文編號(hào)：1676565