本文關(guān)鍵詞：“廢氣不廢”:氣體信號分子硫化氫的研究進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《蘇州大學(xué)》 2014年

硫化氫通過CaMKKβ-AMPK信號通路抑制中樞神經(jīng)炎癥應(yīng)答

周曉梅  

【摘要】：目的：硫化氫（hydrogen sulfide, H2S）是重要的內(nèi)源性氣體信號分子，可以抑制中樞神經(jīng)炎癥，但機(jī)制不明。已有研究表明H2S可能通過核因子-kappaB（NF-κB）和p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路抑制中樞神經(jīng)炎癥。本課題的目的在于探索H2S是否通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）信號通路促進(jìn)腦內(nèi)炎癥細(xì)胞—小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia, MG）向M2另類活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化從而發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥應(yīng)答的作用。 方法：利用BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系及小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞，通過脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激建立體外小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型。利用三種結(jié)構(gòu)不同的H2S供體（NaSH/GYY4137/ADT-OH）以及過表達(dá)內(nèi)源性H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase, CBS）的策略研究H2S抑制中樞神經(jīng)炎癥的機(jī)制。應(yīng)用Griess試劑法通過檢測炎癥介質(zhì)NO的生成探索H2S供體抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥應(yīng)答的有效藥物濃度范圍及最佳效應(yīng)濃度；應(yīng)用Western Blot法檢測AMPK活化（磷酸化）、CBS表達(dá)及AMPK的上游激酶—Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶β（Ca2+/calmodulin dependent protein kinase kinase beta, CaMKKβ）表達(dá)水平的變化；應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）技術(shù)測定表征M1（促炎狀態(tài)）/M2（另類活化狀態(tài)）細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化；同時應(yīng)用AMPK和CaMKKβ抑制劑或siRNA干擾技術(shù)探索H2S抑制中樞神經(jīng)炎癥的作用是否依賴于AMPK/CaMKKβ。最后，通過側(cè)腦室注射LPS建立小鼠中樞神經(jīng)炎癥模型，在動物水平驗(yàn)證H2S供體對LPS刺激導(dǎo)致的AMPK磷酸化及M1/M2細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響；并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察磷酸化AMPK（p-AMPK）與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Ibal的共定位情況，以明確H2S供體在動物水平對小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)及AMPK激活的作用。 結(jié)果：與溶劑對照組相比較，無論BV-2細(xì)胞有無LPS誘導(dǎo)活化，H2S供體（NaSH/GYY4137/ADT-OH）和CBS過表達(dá)均增加其AMPK活化水平；同時，ADT-OH和CBS過表達(dá)均促進(jìn)LPS活化的BV-2細(xì)胞向M2另類活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化；AMPK抑制劑和siRNA均抑制ADT-OH促進(jìn)活化BV-2細(xì)胞向M2另類活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明H2S通過促進(jìn)AMPK活化抑制中樞神經(jīng)炎癥應(yīng)答。 肝激酶B1(1iver-kinase B1, LKB1)是激活A(yù)MPK的上游激酶，但ADT-OH在不表達(dá)LKB1的HeLa細(xì)胞中也能促進(jìn)AMPK活化；而CaMKKβ抑制劑和siRNA均抑制ADT-OH促進(jìn)BV-2細(xì)胞AMPK活化及其向M2另類活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果表明，H2S通過CaMKKβ而不是LKB1激活A(yù)MPK信號通路發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥應(yīng)答的作用。 在LPS刺激小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞的模型上，ADT-OH也促進(jìn)原代小膠質(zhì)細(xì)胞AMPK活化及其向M2另類活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化；AMPK和CaMKKβ抑制劑均抑制ADT-OH促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞AMPK活化及其向M2另類活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化。 在側(cè)腦室注射LPS建立的小鼠中樞神經(jīng)炎癥模型中，ADT-OH和NaSH均促進(jìn)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化密集區(qū)域—腦外側(cè)隔區(qū)復(fù)合體AMPK活化，并且ADT-OH抑制該區(qū)域腦組織M1細(xì)胞因子的表達(dá)而上調(diào)M2細(xì)胞因子的表達(dá)水平；熒光免疫組化結(jié)果顯示在同時注射LPS和ADT-OH的小鼠腦外側(cè)隔區(qū)復(fù)合體可見Ibal+細(xì)胞與p-AMPK共染。這部分結(jié)果從動物水平上證實(shí)H2S通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞AMPK抑制中樞神經(jīng)炎癥應(yīng)答。 結(jié)論與創(chuàng)新：H2S通過CaMKKβ-AMPK信號通路抑制中樞神經(jīng)炎癥應(yīng)答。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R741
【目錄】：

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