本文選題：多酚類　切入點：運動能力　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:人體快速進入高原時,低壓低氧是導致機體運動能力下降的主要原因。這時預先進行階梯習服是最好的預防措施,然而未來軍事斗爭需要部隊快速進駐高原并迅速投入戰(zhàn)斗,因此上述習服方式在戰(zhàn)時的意義不大,需要針對急進高原部隊進行合理的外源性藥物或營養(yǎng)補充劑的干預,據(jù)報道目前可預防高原反應的藥物多數(shù)具有副作用,因此尋找副作用小,能夠預防高原反應并增強機體運動耐力的藥物或營養(yǎng)補充劑顯得尤為重要,相關研究目前已成為運動醫(yī)學,軍事醫(yī)學和營養(yǎng)學跨學科交叉的熱點。回顧文獻并根據(jù)本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),多酚活性化合物因具備良好的抗氧化、清除自由基等多種生物學活性,其應用前景日益受到重視,且多項研究證實其中的代表物槲皮素可以增強機體有氧運動能力和骨骼肌線粒體生物合成。因此本研究提出科學假設:急性低壓低氧條件下機體產(chǎn)生的運動不耐受,主要機理可能是因線粒體功能紊亂并導致的骨骼肌損傷,而多酚活性化合物可能通過作用于骨骼肌線粒體而對急性低壓低氧條件下機體的運動耐力具有保護效應。研究目的:1.通過低壓氧艙建立急性低壓低氧大鼠跑步力竭運動損傷模型,明確多酚活性植物化合物對急性低壓低氧大鼠運動耐力的保護作用,并篩選出有效的化合物;2.闡明急性低壓低氧環(huán)境下骨骼肌線粒體代謝紊亂與運動耐力下降之間的關系,揭示多酚活性化合物產(chǎn)生運動保護作用的分子機制。實驗方法:第一部分:常見多酚活性化合物對急性低壓低氧條件下大鼠運動能力的影響1.實驗大鼠分組給藥:即平原常氧對照組,低壓低氧對照組,紅景天陽性對照組,槲皮素干預組,楊梅素干預組,二氫楊梅素干預組,白藜蘆醇干預組。每種藥物組再根據(jù)設定的給藥劑量分為50mg/kg.bw/d、75 mg/kg.bw/d、100mg/kg.bw/d、150mg/kg.bw/d、200mg/kg.bw/d組,預先連續(xù)灌胃7天,每天1次。2.利用低壓氧艙模擬高原急性低壓低氧條件,并在轉輪式跑步機上完成大鼠跑步力竭實驗來評價大鼠的運動能力,并觀察楊梅素,二氫楊梅素,槲皮素和白藜蘆醇等四種常見多酚活性化合物預防性干預后對急性低壓低氧條件下大鼠力竭時間的影響;3.跑步力竭實驗后收集大鼠血清,利用全自動生化分析儀檢測血清中常規(guī)代謝指標尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平;4.收集大鼠腓腸肌標本,利用透射電鏡觀察各組大鼠骨骼肌超微結構的形態(tài)變化。第二部分:二氫楊梅素對骨骼肌微損傷的保護作用及機制研究第一節(jié)二氫楊梅素通過防止線粒體代謝紊亂來保護骨骼肌微損傷1.二氫楊梅素選取三個劑量組以及力竭實驗對照組大鼠標本,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠骨骼肌細胞呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性;2.提取大鼠腓腸肌組織線粒體DNA,采用實時定量PCR檢測線粒體DNA的表達;3.采用Western blot方法檢測大鼠腓腸肌組織線粒體分裂融合相關蛋白表達。第二節(jié)SIRT3基因在二氫楊梅素保護骨骼肌微損傷效應中的作用和機制1.實驗小鼠分組及給藥方案:野生小鼠隨機分為野生小鼠靜止對照組、野生小鼠運動對照組和野生小鼠DHM運動實驗組;SIRT3基因敲除小鼠隨機分為基因敲除小鼠運動對照組和基因敲除小鼠DHM運動實驗組,DHM取劑量統(tǒng)一為100 mg/kg.bw/d,預先連續(xù)給藥,共持續(xù)4周;2.建立小鼠轉輪跑步骨骼肌微損傷模型,除靜止對照組外,其余四組均連續(xù)進行4周的轉輪跑步疲勞性運動,完成后次日進行一次跑步力竭實驗,24小時后處死并收集小鼠血清和腓腸肌標本;3.采用試劑盒檢測小鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)的水平,以及骨骼肌組織中丙二醛(MDA)含量;4.利用透射電鏡觀察小鼠腓腸肌超微結構的形態(tài)變化;5.采用Western blot方法檢測小鼠腓腸肌組織SIRT3及線粒體功能調(diào)節(jié)蛋白表達;6.利用免疫共沉淀檢測小鼠腓腸肌組織SIRT3-OPA1蛋白表達;7.利用免疫組織化學染色檢測小鼠腓腸肌SIRT3及線粒體功能調(diào)節(jié)蛋白表達。第三部分:楊梅素在低氧環(huán)境維持骨骼肌細胞線粒體生物合成及機制研究1.培養(yǎng)L6大鼠骨骼肌細胞并誘導分化,用real-time PCR方法檢測MYO和MHC的基因表達來明確L6細胞分化程度。分化后,將細胞分為5組:常氧對照組,低氧對照組,楊梅素干預組,SIRT1抑制劑+楊梅素干預組和AMPK抑制劑+楊梅素干預組。將后四組置入低氧細胞培養(yǎng)箱進行16小時的低氧處理;2.采用JC-1方法測定L6大鼠骨骼肌細胞線粒體膜電位變化;3.選取楊梅素三個劑量組及力竭實驗對照組的大鼠標本,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠骨骼肌細胞呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性;4.利用透射電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體超微結構的形態(tài)變化;5.采用Real-time PCR方法檢測大鼠腓腸肌組織和L6骨骼肌細胞線粒體DNA的表達;6.采用Western blot方法檢測大鼠腓腸肌組織和L6骨骼肌細胞線粒體生物合成相關蛋白表達;7.利用免疫組織化學染色檢測大鼠腓腸肌組織線粒體生物合成相關蛋白表達;8.利用免疫熒光化學染色檢測L6骨骼肌細胞線粒體生物合成相關蛋白表達。實驗結果:一、多酚活性化合物槲皮素、楊梅素和二氫楊梅素在急性低壓低氧環(huán)境下對大鼠運動能力有明顯的保護作用。1.急性低壓低氧環(huán)境下大鼠的跑步力竭時間大幅縮短,明顯低于平原常氧對照組大鼠;2.四種常見多酚活性化合物中,除白藜蘆醇外,槲皮素、楊梅素和二氫楊梅素預先干預后大鼠的力竭時間與低壓低氧對照組大鼠相比明顯延長,但劑量-效應曲線有所不同,楊梅素和二氫楊梅素的效用比較突出且類似,在75mg/kg.bw/d劑量組即可產(chǎn)生明顯的效應,而槲皮素需劑量達150mg/kg.bw/d時才能發(fā)揮作用,且效果不及楊梅素和二氫楊梅素;3.急性低壓低氧條件下大鼠運動力竭后,其血清BUN、LDH和CK三個代謝指標水平均顯著升高;4.四種常見多酚活性化合物中只有楊梅素和二氫楊梅素對BUN的影響顯著,二者實驗組大鼠與高原低氧對照組相比血清BUN值明顯下降,而槲皮素和白藜蘆醇對BUN的作用甚微,即便是最高劑量組200mg/kg.bw/d,血清BUN值也只是略有下降,統(tǒng)計學無顯著差異;5.四種常見多酚活性化合物中只有白藜蘆醇對LDH的作用不明顯,其余均可降低大鼠在急性低壓低氧條件下跑步力竭后血清LDH值,三者的劑量-效應曲線區(qū)別較大,其中楊梅素的作用最強;6.四種常見多酚活性化合物中只有白藜蘆醇對血清CK的作用不大,其余三種均可不同程度的降低大鼠在急性低壓低氧暴露下力竭后血清CK水平,其中二氫楊梅素的作用最明顯;7.急性低壓低氧條件下大鼠骨骼肌超微結構表現(xiàn)為不規(guī)則的肌原纖維,Z線模糊且出現(xiàn)散亂,肌質網(wǎng)開始溶解,而二氫楊梅素干預可顯著減輕上述損傷,但其余幾種化合物干預后改善不明顯。二、二氫楊梅素在急性低壓低氧環(huán)境下能有效減輕大鼠骨骼肌超微結構損傷,維持骨骼肌線粒體代謝動力學并保護線粒體增殖以及呼吸鏈活性。1.在急性低壓低氧環(huán)境下大鼠骨骼肌的四種線粒體呼吸鏈酶復合體活性均受到明顯的抑制和損傷,當二氫楊梅素干預劑量達到100mg/kg.bw/d時能夠有效的保護酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性,但對酶復合體Ⅴ的作用并不明顯;2.急性低壓低氧環(huán)境下大鼠骨骼肌細胞線粒體DNA的相對含量急劇降低,而二氫楊梅素干預后,線粒體DNA的相對含量有顯著提升,并且呈現(xiàn)出劑量依賴性;3.急性低壓低氧環(huán)境對大鼠骨骼肌線粒體分裂融合相關的四種調(diào)控蛋白的表達影響很大,其中MFN1和MFN2下降明顯,DRP1和FIS1則顯著上升,而通過二氫楊梅素干預后上述融合蛋白和分裂蛋白的變化趨勢在100mg/kg.bw/d劑量組得到有效抑制。三、SIRT3是二氫楊梅素保護骨骼肌微損傷效用中的關鍵調(diào)節(jié)因子1.二氫楊梅素對野生小鼠過度運動導致的骨骼肌微損傷有明顯保護作用;2.二氫楊梅素對SIRT3基因敲除小鼠過度運動后骨骼肌微損傷無明顯保護作用;3.二氫楊梅素對小鼠過度運動導致的PGC-1α和ERRα表達下調(diào)有明顯的遏制作用,而且這種作用效果并不受SIRT3基因敲除的影響;4.免疫共沉淀的結果顯示SIRT3-OPA1相互作用密切,而Western blot實驗檢測顯示疲勞性運動導致線粒體代謝動力學向分解代謝發(fā)展,而二氫楊梅素干預后這種趨勢得到有效抑制,但這種作用對過度運動的SIRT3基因敲除小鼠沒有效果。四、楊梅素在常氧條件和急性低氧條件下均能促進大鼠骨骼肌細胞線粒體生物合成,并可保護線粒體呼吸鏈酶復合體活性和膜電位,從而糾正線粒體的功能紊亂。1.急性低壓低氧條件下大鼠骨骼肌細胞線粒體結構損傷明顯,而楊梅素干預能有效抵抗這種損傷,并呈現(xiàn)出劑量依賴性;2.急性低壓低氧暴露并跑步力竭后,大鼠腓腸肌細胞的四種線粒體呼吸鏈酶復合體的活性都顯著下降,預先服用楊梅素且劑量達到100mg/kg.bw/d時,酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性有明顯上升;3.急性低氧處理后L6骨骼肌細胞線粒體膜電位顯著下降,而楊梅素預處理后能夠在很大程度上阻止膜電位的下降趨勢;4.楊梅素對急性低氧環(huán)境下大鼠腓腸肌和L6骨骼肌細胞線粒體DNA的下降均有明顯的遏制作用,同時楊梅素在急性低氧條件下能夠維持大鼠腓腸肌細胞以及L6骨骼肌細胞線粒體生物合成相關因子PGC-1a、NRF1和TFAM的蛋白表達;5.常氧環(huán)境下楊梅素干預可明顯促進大鼠骨骼肌線粒體mt DNA相對含量以及PGC-1a,NRF1和TFAM這三個生物合成指標的蛋白表達;6.急性低壓低氧暴露并跑步力竭后,大鼠骨骼肌中AMPK和SIRT1兩個因子的表達顯著下降,而預先補充楊梅素后可明顯抵抗這種下降趨勢;7.使用AMPK特異性抑制劑可以幾乎完全消除楊梅素在低氧條件下對L6細胞線粒體生物合成的保護效應,而SIRT1抑制劑則沒有這種作用。結論:1、多酚類活性化合物槲皮素、楊梅素和二氫楊梅素可以明顯減輕急性低壓低氧環(huán)境下機體運動耐力的下降,其中二氫楊梅素和楊梅素的作用更為顯著,二者的效應均表現(xiàn)出劑量依賴性,在100mg/kg.bw/d這一劑量水平即達到作用最大化。2、二氫楊梅素在急性低壓低氧環(huán)境下能通過維持骨骼肌線粒體代謝動力學即分裂融合的平衡有效減輕大鼠骨骼肌超微結構損傷,另外對骨骼肌線粒體呼吸鏈活性以及增殖都有保護效應,這可能是其防止運動耐力下降的重要原因。3、SIRT3基因在二氫楊梅素減輕骨骼肌微損傷過程中發(fā)揮關鍵作用,其中PGC-1α-SIRT3-OPA1這一作用通路可能是二氫楊梅素發(fā)揮作用的靶點,最終依靠這一通路介導骨骼肌線粒體代謝動力學(分裂融合)狀態(tài)而實現(xiàn)上述效應。4、楊梅素通過促進骨骼肌細胞線粒體生物合成并保護線粒體結構和功能達到在急性低壓低氧暴露下保護大鼠運動能力的效果。其中促進線粒體生物合成的機制可能是通過AMPK-PGC-1a以及AMPK-SIRT1-PGC-1a通路而實現(xiàn)的。綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)楊梅素和二氫楊梅素在急性低壓低氧條件下對大鼠的運動能力有明顯的保護效應,二氫楊梅素主要通過保護骨骼肌微損傷,而楊梅素主要通過促進骨骼肌線粒體生物合成,這與以往抗高原反應藥物的作用靶點有所區(qū)別,該研究進一步開拓了抗高原反應藥物的研究思路。同時為解決急進高原人員快速適應低壓低氧環(huán)境提供了新的策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R82

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本文編號：1573485