本文關(guān)鍵詞： 芥子氣 成纖維細(xì)胞 角質(zhì)細(xì)胞 氧化應(yīng)激 凋亡　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：芥子氣,化學(xué)名二氯二乙基硫醚,屬糜爛性化學(xué)戰(zhàn)劑,1886年,純品是由德國(guó)科學(xué)家梅耶首次合成,在第一次世界大戰(zhàn)、第二次世界大戰(zhàn)及兩伊戰(zhàn)爭(zhēng)中被大規(guī)模使用,是通過(guò)戰(zhàn)爭(zhēng)考驗(yàn)的最有效的化學(xué)戰(zhàn)劑之一,有“毒劑之王”之稱(chēng)。芥子氣還是日遺化武的主要成分,2003年8月4日發(fā)生在齊齊哈爾的毒氣事件元兇就是芥子氣。芥子氣合成工藝簡(jiǎn)單,戰(zhàn)時(shí)恢復(fù)容易,平時(shí)恐怖威脅巨大,但是芥子氣難防難治,目前臨床上僅將芥子氣皮膚中毒視為燒傷處理,進(jìn)行對(duì)癥治療,沒(méi)有特效解毒藥物或方法。皮膚是芥子氣沾染的首要毒性靶器官,是人體防御系統(tǒng)第一道屏障;皮膚分為表皮層和真皮層,表皮層主要由角質(zhì)細(xì)胞組成,真皮層主要由成纖維細(xì)胞組成;氧化應(yīng)激被認(rèn)為是芥子氣毒性作用的起始和關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,關(guān)于芥子氣氧化應(yīng)激毒性機(jī)制國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道,但是氧化應(yīng)激在皮膚損傷中的具體機(jī)制仍不明確。因此從氧化應(yīng)激與短時(shí)間入手,采用體外細(xì)胞模型探索皮膚細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制,對(duì)芥子氣早期防治有重要意義,本課題建立了兩種人源皮膚細(xì)胞模型,并對(duì)兩種細(xì)胞的不同反應(yīng)性做了對(duì)比,關(guān)于Nrf2通路在芥子氣中毒中的作用報(bào)道甚少,本課題發(fā)現(xiàn)Nrf2通路參與了hacat細(xì)胞對(duì)抗芥子氣毒性作用,為以后芥子氣機(jī)制研究及臨床防治奠定基礎(chǔ)。目的研究并比較芥子氣對(duì)人皮膚不同類(lèi)型細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞)的毒性作用及氧化應(yīng)激機(jī)制,探討氧化損傷在芥子氣對(duì)人皮膚細(xì)胞毒性中的作用,為深入研究芥子氣皮膚毒性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法采用胰酶消化法分離人皮膚真皮層成纖維細(xì)胞,獲得穩(wěn)定且純度良好的成纖維細(xì)胞,建立成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?采用CCK-8法檢測(cè)芥子氣對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響,獲得細(xì)胞存活率及半數(shù)抑制濃度,反映芥子氣的細(xì)胞毒性作用;采用DCFH-DA熒光探針染色方法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量,獲得細(xì)胞活性氧劑量-效應(yīng)關(guān)系,利用WST-8法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力,獲得SOD劑量-效應(yīng)關(guān)系,利用MDA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)丙二醛含量,獲得MDA的劑量-效應(yīng)關(guān)系,由此反映細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)和程度;采用Annexin-PI熒光染色法檢測(cè)芥子氣對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,獲得細(xì)胞凋亡的劑量-反應(yīng)關(guān)系,從而反映細(xì)胞的死亡結(jié)局;采用Western Blot檢測(cè)抗氧化通路及細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白Nrf2、caspase-3及細(xì)胞色素C的表達(dá)情況。結(jié)果與討論芥子氣具有顯著的細(xì)胞毒性作用。經(jīng)過(guò)反復(fù)探索實(shí)驗(yàn),成功建立了成纖維細(xì)胞模型,細(xì)胞純化程度高,穩(wěn)定性好;芥子氣作用于成纖維細(xì)胞與hacat細(xì)胞24h,細(xì)胞存活率隨芥子氣濃度的增加而降低,前者半數(shù)抑制濃度為315μM,后者半數(shù)抑制濃度為112μM,說(shuō)明芥子氣具有顯著的細(xì)胞毒性作用且具有劑量依賴(lài)性,hacat細(xì)胞相對(duì)成纖維細(xì)胞對(duì)芥子氣更加敏感,對(duì)芥子氣的耐受性差,由此我們推斷細(xì)胞敏感性的不同可能是芥子氣染毒導(dǎo)致皮膚起泡的原因之一。芥子氣可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。芥子氣作用成纖維細(xì)胞4h,細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨芥子氣濃度的增加顯著增加,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),ROS增加趨勢(shì)漸弱,24h ROS水平無(wú)顯著性變化,芥子氣處理成纖維細(xì)胞4h,細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力隨芥子氣濃度的升高而降低,MDA含量隨芥子氣濃度升高而增多,說(shuō)明芥子氣染毒后的成纖維細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,其抗氧化能力減弱并發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化;而芥子氣作用hacat細(xì)胞24h,細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加并具劑量依賴(lài)性,細(xì)胞內(nèi)SOD酶活力及MDA含量隨芥子氣濃度的升高而升高,其中SOD酶活力在成纖維細(xì)胞中隨芥子氣染毒劑量的升高而降低,但在hacat細(xì)胞中隨芥子氣染毒劑量的升高而升高,發(fā)生這種差異可能的原因是,hacat細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后,為抵御細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS,細(xì)胞抗氧化能力代償性增加。總之,芥子氣可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激且兩種細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)在時(shí)間上具有一定的差異性;芥子氣可致發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,氧化損傷的程度與芥子氣濃度呈正相關(guān)。芥子氣可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡結(jié)局之一,芥子氣作用于兩種細(xì)胞,細(xì)胞均發(fā)生凋亡,且凋亡率隨著芥子氣濃度的升高而升高,說(shuō)明芥子氣可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。活性氧清除劑NAC可對(duì)抗芥子氣對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性作用。芥子氣染毒細(xì)胞經(jīng)過(guò)ROS清除劑NAC處理后,其存活率相對(duì)于芥子氣處理組顯著上升,說(shuō)明NAC可對(duì)抗芥子氣對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性作用。Nrf2通路參與了hacat細(xì)胞對(duì)抗芥子氣的抗氧化過(guò)程。Nrf2是細(xì)胞重要的抗氧化蛋白,芥子氣作用于hacat細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)Nrf2表達(dá)量升高,25μM和100μM升高具有顯著性差異,提示,Nrf2信號(hào)通路參與了細(xì)胞抗氧化過(guò)程。線粒體凋亡通路參與芥子氣誘導(dǎo)hacat細(xì)胞凋亡。芥子氣作用hacat細(xì)胞24h,Caspase-3前體表達(dá)量隨芥子氣濃度升高而降低,25μM和100μM濃度細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Caspase-3剪切體形式,說(shuō)明胱天蛋白酶發(fā)生活化;細(xì)胞色素C在最高濃度時(shí)顯著增加,說(shuō)明線粒體釋放細(xì)胞色素C,線粒體凋亡途徑參與芥子氣誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論本研究從細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡三方面入手,通過(guò)研究并比較芥子氣對(duì)成纖維細(xì)胞及hacat細(xì)胞不同作用效應(yīng),得出以下結(jié)論:芥子氣具有顯著的細(xì)胞毒作用,并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性;不同濃度芥子氣可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不同程度的氧化應(yīng)激,細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,其氧化損傷的程度與芥子氣濃度呈正相關(guān);芥子氣可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡;Nrf2抗氧化通路參與了hacat細(xì)胞對(duì)抗芥子氣的抗氧化過(guò)程;線粒體凋亡通路參與誘導(dǎo)hacat細(xì)胞凋亡。以上結(jié)論為深入研究芥子氣氧化應(yīng)激毒性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。真皮成纖維細(xì)胞與表皮角質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激等方面表現(xiàn)出一定的差異性,這種不同種類(lèi)皮膚細(xì)胞反應(yīng)性的不同或許可成為研究芥子氣毒性特征的突破口。
[Abstract]:This paper deals with the effects of mustard gas on the toxicity of mustard gas to human skin cells . It is suggested that Nrf2 pathway is one of the most effective chemical warfare agents to prevent mustard gas . The effects of mustard gas on cell apoptosis induced by mustard gas increased with the increase of mustard gas concentration . The content of MDA increased with the increase of mustard gas concentration . In this study , there was a significant difference in the expression of Nrf2 in cells , 25 渭M and 100 渭M , suggesting that Nrf2 signaling pathway was involved in the cell apoptosis induced by mustard gas .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R82

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1516588