本文關(guān)鍵詞：谷胱甘肽的研究進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

還原型谷胱甘肽的研究進(jìn)展

     摘要：谷胱甘肽是生物體內(nèi)最重要的低分子活性巰基化合物之一，還原型谷胱甘肽臨床用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內(nèi)分泌疾病等。本文對還原型谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)、生理功能、應(yīng)用和生產(chǎn)的研究進(jìn)展作一綜述。9yn,

    關(guān)鍵詞：還原型谷胱甘肽；結(jié)構(gòu)；功能；生產(chǎn)9yn,

    中圖分類號：Q516文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1672-979X(2009)01-0069-039yn,

    Research Advance on Reduced Glutathione9yn,

    HU Sheng-yao1, NIE Zhi-yan1, YUAN Qin-sheng2*9yn,

    (1. Shanghai Medical Workers College, Shanghai 200237, China; 2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)9yn,

    Abstract：Glutathione is one of the most important low-molecular-mass thiols in organisms. Reduced glutathione is used for liver diseases, tumor, oxygen toxicity, senescence and endocrine diseases in clinical practice. This paper summarizes the progress on the structure, physiological function, application and production of reduced glutathione.9yn,

    Key words：reduced glutathione; structure; function; production9yn,

    谷胱甘肽(glutathione)廣泛存在于動植物和微生物中，是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型(GSH)和氧化型(GSSG)，生物體內(nèi)大量存在并起主要作用的是GSH。GSH廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內(nèi)分泌疾病，并作為生物活性添加劑及抗氧化劑用于食品領(lǐng)域。

    1GSH的結(jié)構(gòu)特征kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵形成，分子中有一特殊的γ-肽鍵，即由谷氨酸的γ-COOH與半胱氨酸的α-NH2縮合成的肽鍵，它不同于蛋白質(zhì)分子中的普通肽鍵。GSH為白色晶體，易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。2分子GSH脫氫后以二硫鍵相連形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，又稱谷胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶于水的白色晶體。kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    2 GSH的生理功能和應(yīng)用kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    GSH分子含有γ-谷氨酰基和活性巰基，是GSH許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1]。GSH在紅細(xì)胞中作為巰基緩沖劑存在，維持血紅蛋白和其它紅細(xì)胞蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基處于還原狀態(tài)。GSH還廣泛存在于其它正常細(xì)胞中，有很強(qiáng)的親和力，能與多種化學(xué)物質(zhì)及其代謝物結(jié)合，清除體內(nèi)氧自由基及其它自由基，具有保護(hù)肝細(xì)胞膜、促進(jìn)肝酶活性、抗氧化、解毒等作用，是人體細(xì)胞內(nèi)的主要代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)[2-5]。GSH還在蛋白質(zhì)和DNA合成、物質(zhì)運(yùn)輸、酶活性、新陳代謝及細(xì)胞保護(hù)等生物學(xué)功能中起著直接或間接的作用。它還是許多酶反應(yīng)的輔基，可作為抗氧化劑保護(hù)生物分子蛋白的巰基，清除體內(nèi)過多的自由基，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝，具有解毒、預(yù)防糖尿病、癌癥及消除疲勞等作用[6]。kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    GSH廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如加入酸奶和嬰兒食品起類似維生素C的穩(wěn)定作用；防止水果罐頭水果褐變；在面制品中起還原和強(qiáng)化氨基酸作用；縮短面包混揉時間[7]；GSH在與谷氨酸鈉、核酸系呈味物質(zhì)或其混合物共存時具有肉類風(fēng)味；GSH可抑制肉食類、魚類和海鮮類食品的核酸分解，延長保鮮期以及提高奶酪質(zhì)量，防止酪蛋白褐變。kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    3GSH的生產(chǎn)方法kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    3.1化學(xué)合成法[8]kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    隨著多肽合成技術(shù)的日趨成熟，現(xiàn)已能用化學(xué)合成法合成GSH，但由于活性產(chǎn)物不易分離，需要化學(xué)拆分，產(chǎn)品純度不高而難以推廣。kk4/l, 百拇醫(yī)藥

    3.2從谷物胚芽中提取GSHkk4/l, 百拇醫(yī)藥

    谷物胚芽特別是小麥胚芽中含有大量GSH。早在1940年代，人們就通過沉淀蛋白質(zhì)從麥胚粗提GSH；1950年代初，利用有機(jī)溶劑從胚芽中抽提GSH。隨后又有應(yīng)用淀粉酶、蛋白酶和高效膜分離技術(shù)簡化操作工藝，提高收率。一般的工藝流程為：提取—鹽析—離子交換(或膜分離)—濃縮—結(jié)晶。此法GSH得率低、成本高、有機(jī)溶劑污染嚴(yán)重、純度不高，而且消耗大量糧食，現(xiàn)已很少使用。

    3.3微生物發(fā)酵生產(chǎn)GSH{g],

    微生物細(xì)胞內(nèi)含有谷胱甘肽，且發(fā)酵周期短、操作簡單、成本低。基本工藝為：發(fā)酵—細(xì)胞破碎—提取分離—GSH。{g],

    GSH在細(xì)胞內(nèi)特殊的生理功能使其對自身合成產(chǎn)生反饋抑制，用誘變手段減弱或消除這種反饋抑制非常重要。近年頗受重視的是將編碼GSH合成酶系的基因克隆到大腸桿菌或酵母中。{g],

    3.3.1E.coli基因重組E.coli菌種細(xì)胞中GSH含量雖較酵母少，但它的遺傳背景清楚、簡單，基因操作方便，菌體繁殖較快。為了消除GSH對GSH合成酶Ⅰ(GSH-I)的反饋抑制，Murata[9]從E.coli中篩選了1株GSH-Ⅰ脫敏的突變株，從中克隆了GSH-Ⅰ基因(gshⅠ)并在E.coli BRC912表達(dá)，使此株GSH合成活性大為提高，產(chǎn)量達(dá)4.81 μmol/g(濕細(xì)胞)。GSH-Ⅰ活性提高后，GSH-Ⅱ就成了合成GSH的限速酶。沈立新等[10]構(gòu)建了含有g(shù)shⅠ和GSH-Ⅱ基因(gshⅡ)的重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入E.coli細(xì)胞，分步進(jìn)行γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的合成，合成率達(dá)3.78 g/L，比同時轉(zhuǎn)入的合成率高42.1 %，既解決了GSH-Ⅰ和GSH-Ⅱ在同一菌株中克隆表達(dá)相互影響的矛盾，又解決了GSH對GH-Ⅰ的反饋抑制，降低了ADP對第二步反應(yīng)的抑制程度。{g],

    3.3.2酵母基因重組酵母糖酵解產(chǎn)生的ATP是GSH合成過程中不可少的能量供體。利用基因工程手段增加酵母中GSH合成酶系活性是提高GSH合成率的另一有效途徑。Tazuka等[11]將E.coli B中g(shù)shⅠ基因片段與S.cerevisiae 98的1個啟動子融合，融合的GSH-Ⅰ在酵母中表達(dá)，結(jié)果GSH-Ⅰ活性和GSH的含量分別提高了100多倍和3倍多。Christine[12]將帶有g(shù)shI、gshII各1個拷貝的質(zhì)粒PINE III轉(zhuǎn)化入啤酒酵母，GSH產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總干重的1.8 %，大大高于對照菌株。此外，通過優(yōu)化菌株的培養(yǎng)表達(dá)條件也可提高GSH產(chǎn)量。有研究通過反饋控制乙醇濃度流加葡萄糖，利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵后期添加3種氨基酸配比和濃度，進(jìn)行釀酒酵母T65補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)GSH，產(chǎn)量達(dá)到2.19 g/L[13-15]。衛(wèi)功元等[16-18]研究了溫度、pH、溶氧和補(bǔ)料流加速度對產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)GSH的影響，發(fā)現(xiàn)較高溫度對細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，較低溫度則更有利于提高GSH產(chǎn)量，pH 5.5時對細(xì)胞生長和GSH合成均最佳，恒溶氧控制發(fā)酵可明顯提高細(xì)胞干重和GSH產(chǎn)量，當(dāng)恒溶氧濃度35 %時，二者的提高幅度可分別達(dá)到22 %和30 %，指數(shù)流加是較理想的補(bǔ)料方式。經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)，GSH產(chǎn)量達(dá)到857.2 mg/L。

    除E.Coli和酵母外，傅瑞燕等[19]構(gòu)建了重組乳酸乳球菌生產(chǎn)GSH，用乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)4 h后，胞內(nèi)GSH含量達(dá)到358 nmol/mg蛋白質(zhì)。iaw, 百拇醫(yī)藥

    3.4酶工程法合成GSHiaw, 百拇醫(yī)藥

    用分離提取的酶或游離細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，減少了細(xì)胞代謝副產(chǎn)物對分離提取的影響，簡化了下游工藝。早期研究中用去污劑和溶壁酶處理啤酒酵母增大細(xì)胞的通透性，加入含有葡萄糖、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸等前體的反應(yīng)液，GSH產(chǎn)量大大增高，達(dá)9.06 g/L。也有人將經(jīng)甲苯通透處理后的重組E.coli與干酵母細(xì)胞一起加入反應(yīng)體系，GSH含量達(dá)5 mg/mL。由于游離酶難以重復(fù)使用，并影響產(chǎn)物的分離提取，故用固定化酶催化合成GSH。將自溶后的啤酒酵母分離出GSH合成酶，用聚丙烯酰胺凝膠包埋后加入反應(yīng)液，半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為87 ％（游離酶為47 ％），且穩(wěn)定性提高。iaw, 百拇醫(yī)藥

    用固定化細(xì)胞法具有特定的優(yōu)勢，這是因為：（1）GSH合成酶是雙酶體系，酶的分離提取更加繁瑣，用固定化細(xì)胞催化合成GSH避免了繁雜的酶分離過程；（2）GSH合成過程需ATP作能量供體，實際生產(chǎn)過程中不可能直接加入ATP，而且ATP利用后生成的ADP對GSH-Ⅰ及GSH-Ⅱ有抑制作用，因此，提供合適的ATP再生體系無論從經(jīng)濟(jì)角度還是從酶反應(yīng)角度均較為合理。ATP再生由酶系完成，固定化細(xì)胞可以利用相應(yīng)菌株細(xì)胞內(nèi)的ATP再生酶系和GSH合成酶系，通過偶聯(lián)或與其它GSH合成酶活性較高菌株固定化細(xì)胞的種間聯(lián)合成GSH，其優(yōu)勢是固定化酶法合成GSH無法比擬的。iaw, 百拇醫(yī)藥

    謝雷波等[20]將S.cerevisiae TB6用卡拉膠與魔芋粉混合載體固定合成谷胱甘肽，在pH 7.0，37 ℃，磷酸鹽緩沖液0.1 %的條件下反應(yīng)6 h，固定化細(xì)胞合成GSH產(chǎn)量為550 mg/L。iaw, 百拇醫(yī)藥

    與固定化酵母生產(chǎn)GSH相比，含GSH合成酶系的重組E.coli具有穩(wěn)定性好、成本低廉等優(yōu)點，但須解決GSH合成過程中ATP再生的問題。已有許多ATP再生方法和GSH酶反應(yīng)偶聯(lián)合成GSH。利用E.coli細(xì)胞的乙酸激酶和GSH合成酶系，以乙酰磷酸為磷酸供體將ADP等再生為ATP，合成GSH，偶聯(lián)效果較好。但乙酰磷酸成本較高且不穩(wěn)定，難以工業(yè)化生產(chǎn)。沈立新等[21]用卡拉膠固定E.coli生產(chǎn)GSH，優(yōu)化條件下罐式反應(yīng)器GSH的產(chǎn)量為 0.84 g/L，穩(wěn)定性較好；此外，與酵母生產(chǎn)ATP體系相偶聯(lián)的共固定化體系在填充床中反應(yīng)，GSH合成量達(dá)1.24 g/L，收率比直接加入ATP提高24.2 %。童群義等[22]將E.coli與啤酒酵母用PVA-卡拉膠混合載體固定生產(chǎn)GSH，比單一固定化E.coli或單一固定化啤酒酵母效果好，但GSH合成無明顯提高。主要是由于偶聯(lián)體系在磷酸鹽緩沖液濃度的不協(xié)調(diào)性引起的，再生ATP的高濃度磷酸鹽緩沖液對GSH合成酶系產(chǎn)生抑制作用；而且ADP、ATP在E.coli和酵母兩體系間的傳遞受到限制，也影響了偶聯(lián)體系GSH合成效率。

    目前國內(nèi)外常用的GSH工業(yè)生產(chǎn)方法是酵母發(fā)酵法，，工藝較成熟，但產(chǎn)量有待提高。與ATP再生體系偶聯(lián)合成GSH，乙酰激酶盡管效率較高，但乙酰磷酸的高價格及穩(wěn)定性限制了此法的產(chǎn)業(yè)化；酵母糖酵解途徑成本低廉，雖在胞二磷膽堿和NADP的合成方面獲得成功，但合成GSH的效率較低，主要是ATP再生反應(yīng)效率不高，反應(yīng)條件與GSH酶系催化合成GSH的條件不協(xié)調(diào)以及由此造成的成本較高限制了此方法潛力的發(fā)揮。|'\,

    4結(jié)語和展望|'\,

    由于GSH應(yīng)用廣泛，有關(guān)GSH的研究報道很多，但大都是GSH生物體內(nèi)生理功能的體現(xiàn)及用于疾病治療等內(nèi)容。目前GSH價格高，使其推廣應(yīng)用受到限制。盡管日本已實現(xiàn)了酵母發(fā)酵法制備GSH的產(chǎn)業(yè)化，并已將研究結(jié)果以專利形式公布，但是如何提高發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本仍有一些問題需要研究：（1）選育性能良好的GSH高產(chǎn)菌株或通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建基因工程菌合成GSH；（2）環(huán)境條件（溫度、pH、溶氧等）和培養(yǎng)基成分對GSH生產(chǎn)的影響及其發(fā)酵動力學(xué)規(guī)律；（3）GSH生產(chǎn)菌株高密度培養(yǎng)過程中各種關(guān)鍵因素（如CO2抑制和O2供給等）的解決；（4）如何使胞內(nèi)合成的GSH分泌至胞外，解決胞內(nèi)GSH高積累產(chǎn)生的反饋抑制；（5）建立和優(yōu)化發(fā)酵調(diào)控策略，利用多尺度參數(shù)實現(xiàn)GSH生產(chǎn)過程的優(yōu)化控制；（6）進(jìn)一步建立和優(yōu)化分離純化工藝，提高GSH產(chǎn)率。|'\,

    參考文獻(xiàn)|'\,

    [1]Franco R, Schoneveld O J, Pappa A, et al. The central role of glutathione in the pathophysiology of human diseases[J]. Arch Physiol Biochem, 2007, 113(4-5): 234-258.|'\,

    [2]Wisnewski A V, Liu Q, Liu J, et al. Glutathione protects human airway proteins and epithelial cells from isocyanates[J]. Clin Exp Allergy, 2005, 35(3): 352-357.|'\,

    [3]侯春蘭，王曉輝. 還原型谷胱甘肽對老年慢性活動性乙型肝炎療效觀察[J]. 實用老年醫(yī)學(xué)，2006，20(5): 352-353.

    [4]金怒云，余小虎，顧國妹，等. 還原型谷胱甘肽聯(lián)合二甲雙胍治療非酒精性脂肪肝療效觀察[J]. 實用肝臟病雜志，2006，9（5）：266-268./:2,

    [5]馮蝶儀, 劉琨. 還原型谷胱甘肽治療抗結(jié)核藥物性肝損[J]. 臨床肺科雜志，2006，11（6）：743-744./:2,

    [6]Wu G, Fang Y Z, Yang S, et al. Glutathione metabolism and its implications for health[J]. J Nutr, 2004, 134(3): 489-492./:2,

    [7]冮潔，單立峰. 谷胱甘肽的制備及其應(yīng)用[J]. 飼料工業(yè)，2007，28（15）：15-17./:2,

    [8]Cacciatore I, Caccuri A M, Di Stefano A, et al. Synthesis and activity of novel glutathione analogues containing an urethane backbone linkage[J]. Farmaco, 2003, 58(9): 787-793./:2,

    [9]Murata K, Kimura A. Overproduction of glutathione and its derivatives by genetically engineered microbial cells[J]. Biotechnol Adv, 1990, 8(1): 59-96./:2,

    [10] 沈立新，魏東芝，堯輝. 重組大腸桿菌催化合成谷胱甘肽的研究[J]. 西北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，33（5）：554-557./:2,

    [11] Ohtake Y, Watanabe K, Tezuka H, et al. Expression of glutathione synthetase gene of Escherichia coli B in Saccharomyces cerevisiae[J]. J Ferment Bioeng, 1989, 68: 390-399./:2,

    [12] Christine L H. Recombinant yeast for manufacture of glutathione[P]. EP 300 168, 1989.

    [13] Wen S H, Zhang T, Tan T W. Maximizing production of glutathione by amino acid modulation and high-cell-density fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae[J]. Process Biochem, 2006, 41(12): 2424-2428.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [14] Wang Z, Tan T W, Song J. Effect of amino acids addition and feedback control strategies on the high-cell-density cultivation of Saccharomyces cerevisiae for glutathione production[J]. Process Biochem, 2007, 42(1): 108-111.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [15] Wen S H, Zhang T, Tan T W. Optimization of the amino acid composition in glutathione fermentation[J]. Process Biochem, 2005, 40(11): 3474-3479.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [16] 衛(wèi)功元，王大慧，陳堅. 不同溶氧控制方式下的谷胱甘 肽分批發(fā)酵過程分析[J]. 化工學(xué)報，2007，58（9）：2329-2335.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [17] 衛(wèi)功元，李寅，堵國成，等. 溫度對谷胱甘肽分批發(fā)酵的影響及動力學(xué)模型[J]. 生物工程學(xué)報，2003，19（3）：358-363.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [18] 衛(wèi)功元，李寅，堵國成，等. 產(chǎn)朊假絲酵母流加發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽[J]. 過程工程學(xué)報，2005，5（3）：327-331.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [19] 傅瑞燕，陳堅，李寅. 構(gòu)建重組乳酸乳球菌生產(chǎn)谷胱甘肽[J]. 生物加工過程，2004，2（2）：30-35.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [20] 謝雷波，段學(xué)輝，王錦，等. κ-卡拉膠與魔芋粉混合載體固定酵母細(xì)胞生物合成谷胱甘肽[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報（工科版），2006，28（1）：19-22.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [21] 沈立新，魏東芝，張嗣良，等. 固定化E.coli BL21(pTrc-gsh)細(xì)胞催化合成谷胱甘肽[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報，2002，28（1）：24-27.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    [22] 童群義，陳堅，堵國成，等. PVA-卡拉膠混合載體固定化大腸桿菌-酵母菌混合體系生產(chǎn)谷胱甘肽[J]. 工業(yè)微生物，2000，30（4）：1-5.]l(60, 百拇醫(yī)藥

    (胡圣堯 聶志妍 袁勤生)

  本文關(guān)鍵詞：谷胱甘肽的研究進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。