本文關(guān)鍵詞：缺氧復(fù)合梭曼中毒PC12細胞中JAK-STAT信號通道變化的研究

  更多相關(guān)文章： 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞 酪氨酸蛋白激酶 白細胞介素 Janus 激酶(JAK) 信號的轉(zhuǎn)錄子和活化子(STAT) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng) 蛋白質(zhì)印跡 RNA雜交 電泳遷移率改變分析法

【摘要】： 梭曼屬于速殺性化學(xué)戰(zhàn)劑，可以迅速地抑制乙酰膽堿酯酶(AchE)，導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿(Ach)積累，引發(fā)動物出現(xiàn)呼吸困難、肌顫、驚厥，甚至死亡�？焖龠M駐高原地區(qū)可造成機體缺氧性損傷，高原缺氧復(fù)合梭曼中毒可加大其毒性。這種低氧復(fù)合梭曼中毒所致的腦損傷至今對其發(fā)病機制尚不十分清楚，因而也缺少有效的防治措施。JAK-STAT傳導(dǎo)通路是最近發(fā)現(xiàn)的信號傳導(dǎo)通路，許多生理及病理生理反應(yīng)都是由這一系統(tǒng)介導(dǎo)而發(fā)生的繼發(fā)效應(yīng)。然而JAK-STAT傳導(dǎo)通路在缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷中的作用機制還未見研究。 目的：本研究利用PC12細胞、大鼠的缺氧及梭曼中毒模型，觀察了缺氧及缺氧復(fù)合梭曼中毒腦組織JAK-STAT的信號傳導(dǎo)過程的功能變化及組成這一傳導(dǎo)途徑的信號蛋白分子的基因轉(zhuǎn)錄和表達的變化，旨在闡明缺氧及缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷信號傳導(dǎo)通道及其構(gòu)成的分子基礎(chǔ)，為高原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷的預(yù)防和臨床救治提供一種新的研究思路。 方法：本實驗應(yīng)用流式細胞儀、免疫組化、蛋白印跡、RNA 印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)、雙脫氧鏈終止法測序等方法，從整體動物水平和細胞水平觀察了缺氧、梭曼中毒單一與復(fù)合缺氧致傷后JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路各信號分子表達狀況。 結(jié)果及結(jié)論： 1．缺氧或梭曼中毒后PC12細胞的存活率呈下降趨勢,且隨缺氧或梭曼中毒時間的延長,存活率降低越明顯；缺氧復(fù)合梭曼中毒后PC12細胞活性隨時間延長而遞減，在24h明顯低于其它時相點。提示缺氧或梭曼中毒均能對PC12細胞產(chǎn)生毒性，在復(fù)合致傷的作用下，細胞毒性加大，細胞存活率在損傷后呈進行性下降、損傷程度具有早而重的特點。 2. 缺氧或梭曼中毒能刺激PC12細胞IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13的分泌。作用2h活性升高，6h(12h)活性水平最高，12h(24h)活性降低；其它組均低于作用6h(12h)組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h活性水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對照組。缺氧或梭曼中毒刺激PC12細胞表達IL-6 mRNA、GP130 mRNA和GP130蛋白； 2h水平 WP=9 升高，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h表達水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對照組。提示缺氧和或梭曼中毒均可刺激JAK—STAT信號傳導(dǎo)通路的上游分子--IL分泌增多，在復(fù)合致傷的作用下，這種效應(yīng)加重并且時間提前。 3．缺氧或梭曼中毒可激活PC12細胞胞漿、胞核的酪氨酸蛋白激酶 (TPK)活性，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。但PC12細胞胞膜的TKR活性降低。在復(fù)合致傷的作用下，這種效應(yīng)加重并且時間提前。提示酪氨酸蛋白激酶在缺氧復(fù)合梭曼中毒過程中細胞內(nèi)信號傳遞方面起了重要的作用。 4. 缺氧或梭曼中毒可引起PC12細胞的JAK1、2、3 mRNA和p-JAK1、2和JAK3蛋白表達水平升高，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h表達水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對照組。TYK2在正常組或低氧處理細胞中均不表達。RT-PCR產(chǎn)物直接測序證實擴增產(chǎn)物片斷與Genbank中相應(yīng)序列相同。提示缺氧或梭曼中毒均可增強PC12細胞中JAK基因和蛋白的表達。復(fù)合致傷的作用下，可增加JAK基因和蛋白的表達量，并且時間提前。 5. 缺氧或梭曼中毒可引起PC12細胞的STAT1、2、3、5、6 mRNA和磷酸化蛋白表達水平升高，，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h表達水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對照組。STAT4未見表達。RT-PCR產(chǎn)物直接測序證實擴增產(chǎn)物片斷與Genbank中相應(yīng)序列相同。免疫組化顯示缺氧復(fù)合梭曼中毒6h，腦組織海馬、皮層神經(jīng)細胞中p-STAT1、3、5陽性染色較弱，主要分布于細胞核內(nèi)， 12h組時陽性表達達高峰，胞核染成棕褐色。提示缺氧或梭曼中毒均可增強PC12細胞中STAT基因和磷酸化蛋白的表達。復(fù)合致傷的作用下，可增加STAT基因和磷酸化蛋白的表達量，并且時間提前。 6. 缺氧可引起PC12細胞的HIF 1α、HIF 1β mRNA和蛋白表達水平升高，6h水平最高，12h水平降低；其它組均低于作用6h組。缺氧后NF-κB的活性6h達到高峰，12h水平降低。加入JAK2的抑制劑AG490后缺氧6h NF-κB的活性明顯降低。提示在缺氧的條件下，JAK-STAT信號通路也可介導(dǎo)對缺氧損傷的保護作用。 7．正常情況下PC12細胞中c-fos陽性較弱，主要分布于細胞核內(nèi)，梭曼中毒6h后陽性著色明顯增強，染色呈棕黃色；在缺氧復(fù)合梭曼中毒6h胞核內(nèi)陽性著色顯著增強，染色呈深棕黃色，加入抑制劑AG490后胞核內(nèi)的陽性著色減弱。提示c-fos可能是JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路的下游分子，在高原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷機制中起重要的作用。 綜上所述缺氧和/或梭曼中毒作用后PC12細胞的JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路及其組成這一通路的各信號分子的表達發(fā)生變化，推測JAK－STAT信號傳導(dǎo)通路參與了高 WP=10 原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷機制，從而為高原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷的救治新藥物的研究提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R82

【參考文獻】

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本文編號：1276034