本文關(guān)鍵詞：缺氧復(fù)合梭曼中毒PC12細(xì)胞中JAK-STAT信號(hào)通道變化的研究

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【摘要】： 梭曼屬于速殺性化學(xué)戰(zhàn)劑，可以迅速地抑制乙酰膽堿酯酶(AchE)，導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿(Ach)積累，引發(fā)動(dòng)物出現(xiàn)呼吸困難、肌顫、驚厥，甚至死亡�？焖龠M(jìn)駐高原地區(qū)可造成機(jī)體缺氧性損傷，高原缺氧復(fù)合梭曼中毒可加大其毒性。這種低氧復(fù)合梭曼中毒所致的腦損傷至今對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，因而也缺少有效的防治措施。JAK-STAT傳導(dǎo)通路是最近發(fā)現(xiàn)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，許多生理及病理生理反應(yīng)都是由這一系統(tǒng)介導(dǎo)而發(fā)生的繼發(fā)效應(yīng)。然而JAK-STAT傳導(dǎo)通路在缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷中的作用機(jī)制還未見(jiàn)研究。 目的：本研究利用PC12細(xì)胞、大鼠的缺氧及梭曼中毒模型，觀察了缺氧及缺氧復(fù)合梭曼中毒腦組織JAK-STAT的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的功能變化及組成這一傳導(dǎo)途徑的信號(hào)蛋白分子的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的變化，旨在闡明缺氧及缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷信號(hào)傳導(dǎo)通道及其構(gòu)成的分子基礎(chǔ)，為高原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷的預(yù)防和臨床救治提供一種新的研究思路。 方法：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀、免疫組化、蛋白印跡、RNA 印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、雙脫氧鏈終止法測(cè)序等方法，從整體動(dòng)物水平和細(xì)胞水平觀察了缺氧、梭曼中毒單一與復(fù)合缺氧致傷后JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路各信號(hào)分子表達(dá)狀況。 結(jié)果及結(jié)論： 1．缺氧或梭曼中毒后PC12細(xì)胞的存活率呈下降趨勢(shì),且隨缺氧或梭曼中毒時(shí)間的延長(zhǎng),存活率降低越明顯；缺氧復(fù)合梭曼中毒后PC12細(xì)胞活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞減，在24h明顯低于其它時(shí)相點(diǎn)。提示缺氧或梭曼中毒均能對(duì)PC12細(xì)胞產(chǎn)生毒性，在復(fù)合致傷的作用下，細(xì)胞毒性加大，細(xì)胞存活率在損傷后呈進(jìn)行性下降、損傷程度具有早而重的特點(diǎn)。 2. 缺氧或梭曼中毒能刺激PC12細(xì)胞IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13的分泌。作用2h活性升高，6h(12h)活性水平最高，12h(24h)活性降低；其它組均低于作用6h(12h)組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h活性水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對(duì)照組。缺氧或梭曼中毒刺激PC12細(xì)胞表達(dá)IL-6 mRNA、GP130 mRNA和GP130蛋白； 2h水平 WP=9 升高，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h表達(dá)水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對(duì)照組。提示缺氧和或梭曼中毒均可刺激JAK—STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路的上游分子--IL分泌增多，在復(fù)合致傷的作用下，這種效應(yīng)加重并且時(shí)間提前。 3．缺氧或梭曼中毒可激活PC12細(xì)胞胞漿、胞核的酪氨酸蛋白激酶 (TPK)活性，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。但PC12細(xì)胞胞膜的TKR活性降低。在復(fù)合致傷的作用下，這種效應(yīng)加重并且時(shí)間提前。提示酪氨酸蛋白激酶在缺氧復(fù)合梭曼中毒過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞方面起了重要的作用。 4. 缺氧或梭曼中毒可引起PC12細(xì)胞的JAK1、2、3 mRNA和p-JAK1、2和JAK3蛋白表達(dá)水平升高，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h表達(dá)水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對(duì)照組。TYK2在正常組或低氧處理細(xì)胞中均不表達(dá)。RT-PCR產(chǎn)物直接測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物片斷與Genbank中相應(yīng)序列相同。提示缺氧或梭曼中毒均可增強(qiáng)PC12細(xì)胞中JAK基因和蛋白的表達(dá)。復(fù)合致傷的作用下，可增加JAK基因和蛋白的表達(dá)量，并且時(shí)間提前。 5. 缺氧或梭曼中毒可引起PC12細(xì)胞的STAT1、2、3、5、6 mRNA和磷酸化蛋白表達(dá)水平升高，，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它組均低于作用6h (12h) 組。缺氧復(fù)合梭曼中毒組6h表達(dá)水平最高，明顯高于梭曼中毒組和正常對(duì)照組。STAT4未見(jiàn)表達(dá)。RT-PCR產(chǎn)物直接測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物片斷與Genbank中相應(yīng)序列相同。免疫組化顯示缺氧復(fù)合梭曼中毒6h，腦組織海馬、皮層神經(jīng)細(xì)胞中p-STAT1、3、5陽(yáng)性染色較弱，主要分布于細(xì)胞核內(nèi)， 12h組時(shí)陽(yáng)性表達(dá)達(dá)高峰，胞核染成棕褐色。提示缺氧或梭曼中毒均可增強(qiáng)PC12細(xì)胞中STAT基因和磷酸化蛋白的表達(dá)。復(fù)合致傷的作用下，可增加STAT基因和磷酸化蛋白的表達(dá)量，并且時(shí)間提前。 6. 缺氧可引起PC12細(xì)胞的HIF 1α、HIF 1β mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，6h水平最高，12h水平降低；其它組均低于作用6h組。缺氧后NF-κB的活性6h達(dá)到高峰，12h水平降低。加入JAK2的抑制劑AG490后缺氧6h NF-κB的活性明顯降低。提示在缺氧的條件下，JAK-STAT信號(hào)通路也可介導(dǎo)對(duì)缺氧損傷的保護(hù)作用。 7．正常情況下PC12細(xì)胞中c-fos陽(yáng)性較弱，主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，梭曼中毒6h后陽(yáng)性著色明顯增強(qiáng)，染色呈棕黃色；在缺氧復(fù)合梭曼中毒6h胞核內(nèi)陽(yáng)性著色顯著增強(qiáng)，染色呈深棕黃色，加入抑制劑AG490后胞核內(nèi)的陽(yáng)性著色減弱。提示c-fos可能是JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游分子，在高原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷機(jī)制中起重要的作用。 綜上所述缺氧和/或梭曼中毒作用后PC12細(xì)胞的JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路及其組成這一通路的各信號(hào)分子的表達(dá)發(fā)生變化，推測(cè)JAK－STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了高 WP=10 原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷機(jī)制，從而為高原缺氧復(fù)合梭曼中毒腦損傷的救治新藥物的研究提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類(lèi)號(hào)】：R82

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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3 王關(guān)嵩,錢(qián)桂生,蔡文琴,周德山,關(guān)崧;大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子亞型Ⅱ基因的克隆及序列分析[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

4 錢(qián)頻,王關(guān)嵩,蒙偉宗,關(guān)崧,陳維中;低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子基因表達(dá)的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

5 陳德英,蔡文琴,王關(guān)嵩;低氧時(shí)復(fù)合培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Janus激酶蛋白表達(dá)的狀況[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

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7 景德強(qiáng),陳爾瑜;梭曼誘發(fā)驚厥后腦內(nèi)信號(hào)物質(zhì)及細(xì)胞程序死亡相關(guān)基因表達(dá)變化的定位研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1997年04期

8 景德強(qiáng),陳爾瑜,余爭(zhēng)平,程天民;梭曼急性中毒誘發(fā)大鼠腦干兒茶酚胺神經(jīng)元表達(dá)c-fos[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1998年06期

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10 郭甫坤,吳曙光;白介素1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2001年01期

本文編號(hào)：1276034