本文關(guān)鍵詞：紅景天中苷（苷元）類成分的抗輻射活性及其在Caco-2模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 紅景天 抗輻射 抗氧化 Caco-2單層模型

【摘要】：隨著我國“神州”載人航天飛行的圓滿成功，目前載人航天已成為我國一項重大的系統(tǒng)工程，被列入國家的經(jīng)濟(jì)建設(shè)計劃中。在長期航天飛行中，空間輻射是危害宇航員健康的主要因素之一。提高航天員對空間特殊環(huán)境的適應(yīng)能力和耐受能力，有效保障航天員健康是確保航天任務(wù)圓滿完成的重要前提。 景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.）植物為多年生草本或亞灌木植物，已有研究證明其具有明顯的抗輻射、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等作用。但目前對紅景天的研究僅限于對其粗提物或紅景天苷的研究，對于其它活性成分的作用以及可能的機(jī)制則尚無系統(tǒng)的研究報道。苯乙素糖苷-紅景天苷(苷元為酪醇)和苯丙素糖苷-洛塞琳、絡(luò)薩維(苷元為肉桂醇)是紅景天屬植物的兩類主要活性成分，具有獨(dú)特的藥理功能，因而成為近年來紅景天活性研究的熱點(diǎn)。 本研究針對紅景天中苷（苷元）類成分，從輻射防護(hù)的抗氧化機(jī)制和免疫保護(hù)作用兩個角度切入，通過建立體外抗氧化模型和輻射所致的淋巴細(xì)胞損傷模型，對紅景天中苷（苷元）類成分進(jìn)行輻射防護(hù)活性評價，篩選得到抗輻射活性成分�；诤Y選評價的結(jié)果，通過Caco-2單層細(xì)胞體外滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型對目標(biāo)抗輻射活性成分的口服吸收情況進(jìn)行預(yù)測，對其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及影響因素進(jìn)行初步探討，評估其作為輻射防護(hù)劑的可行性，為進(jìn)一步深入了解其在體內(nèi)的口服吸收情況以及生物利用度等問題提供實驗依據(jù)，為下一步開發(fā)高效、低毒的輻射防護(hù)劑提供基礎(chǔ)研究資料，為潛在輻射防護(hù)劑的研發(fā)和利用奠定實驗基礎(chǔ)。 本研究主要圍繞以下三方面內(nèi)容展開： （一）從輻射防護(hù)的抗氧化機(jī)理出發(fā)，利用自由基清除原理建立并優(yōu)化六種體外抗氧化模型，系統(tǒng)地對紅景天中苷（苷元）類成分的抗氧化活性進(jìn)行評價。 輻射生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的最根本原因，是由于射線作用于機(jī)體導(dǎo)致的生物分子電離和激發(fā)的直接作用，以及由此產(chǎn)生超氧陰離子，羥自由基等活性氧（Reactiveoxygen species，ROS）導(dǎo)致的繼發(fā)作用，如核酸分子、蛋白質(zhì)分子以及生物膜的損傷等。因此，清除已經(jīng)形成的ROS或者抑制其產(chǎn)生，是輻射防護(hù)的主要途徑之一。本研究建立并優(yōu)化了DPPH自由基、NBT-NADH-PMS體系、羥自由基、氮氧自由基（NO）、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)體系和鐵離子抗氧化體系六種抗氧化模型，分別測定了蘆丁苷、紅景天苷、異槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷、絡(luò)薩維和肉桂醇對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基和NO自由基四種自由基的清除能力，以及對脂質(zhì)過氧化的抑制能力和總抗氧化能力。結(jié)果表明，紅景天中的苷（苷元）類化學(xué)成分從不同方面表現(xiàn)出抗氧化活性：紅景天苷、酪醇、洛塞琳、絡(luò)薩維和肉桂醇表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力（IC_(50)分別為18.97μg·mL~(-1)，10.84μg·mL~(-1)，61.84μg·mL~(-1)，81.08μg·mL~(-1)，26.00μg·mL~(-1)）。蘆丁苷和異槲皮苷表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基和超氧陰離子清除能力，抗脂質(zhì)過氧化和總抗氧化能力；熊果苷的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力較強(qiáng)。 （二）從輻射防護(hù)劑的免疫保護(hù)作用出發(fā)，利用細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)實驗方法建立體外輻射防護(hù)模型，在細(xì)胞水平上對紅景天中苷（苷元）類化合物的體外抗輻射活性進(jìn)行評價。 免疫系統(tǒng)是輻射損傷的重要靶器官，具有高度的輻射敏感性。淋巴細(xì)胞損傷是輻射導(dǎo)致機(jī)體免疫功能抑制的重要原因，因此有效地保護(hù)淋巴細(xì)胞免受輻射損傷對降低機(jī)體輻射損傷有重要意義。本研究先通過細(xì)胞增殖檢測方法比較，細(xì)胞輻射敏感性研究，增殖與輻照的量效關(guān)系考察等方面，對建立體外輻射防護(hù)模型進(jìn)行了方法學(xué)評價；又在確保受試物對細(xì)胞無毒的基礎(chǔ)上，通過給予人淋巴母細(xì)胞(AHH-1)10Gy~(60)Co-γ射線一次性照射建立輻射損傷模型，以MTS法檢測紅景天苷、蘆丁苷、異槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷和絡(luò)薩維對受到輻射后AHH-1細(xì)胞的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，異槲皮苷(12.5μg.mL~(-1)，P 0.05)、紅景天苷(12.5μg.mL~(-1)，P 0.05)、酪醇(50μg.mL~(-1)，P 0.05)、洛塞琳(25μg.mL~(-1)，P 0.05)、絡(luò)薩維(12.5μg.mL~(-1)，P 0.01)和熊果苷(12.5μg.mL~(-1)，P 0.01)均能夠顯著提高輻射損傷AHH-1的增殖活性�；诳寡趸c免疫保護(hù)兩部分實驗結(jié)果，確定了紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維為目標(biāo)抗輻射活性成分，進(jìn)行下一步的滲透轉(zhuǎn)運(yùn)研究。 （三）建立用于藥物吸收研究Caco-2滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型，評價目標(biāo)抗輻射活性成分的口服吸收情況，初步探討其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。 通過觀察細(xì)胞單層形態(tài)，，監(jiān)測跨膜電阻（TEER）值的變化以及比較普萘洛爾和阿替洛爾兩種標(biāo)記物在單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)特性等指標(biāo)對Caco-2細(xì)胞單層模型的可靠性進(jìn)行評價。結(jié)果顯示，TEER值在Caco-2細(xì)胞單層形成過程中穩(wěn)定上升，達(dá)到實驗?zāi)Ｐ鸵髽?biāo)準(zhǔn)（500Ω·cm~2）。胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記物普萘洛爾（高滲透性藥物，表觀滲透系數(shù)（Papp）=1.01×10~(-5)cm·s~(-1)）和胞間轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記物阿替洛爾（低滲透性藥物，Papp=2.20×10-7cm·s~(-1)）呈現(xiàn)可預(yù)見的高、低Papp值，表明建立的Caco-2細(xì)胞模型在完整性、通透性等方面均符合小腸吸收機(jī)制研究的要求。結(jié)合抗氧化與體外AHH-1模型兩部分實驗結(jié)果，選定抗氧化作用和保護(hù)~(60)Co-γ射線輻照后AHH-1細(xì)胞兩方面作用均較強(qiáng)的紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維為目標(biāo)抗輻射活性成分，通過體外Caco-2滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型對這四個成分的腸毒性、吸收情況及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究。本研究通過考察抗輻射活性成分對Caco-2細(xì)胞24h的細(xì)胞毒性作用，對目標(biāo)成分的腸毒性進(jìn)行評估，并推算其用于轉(zhuǎn)運(yùn)模型的安全劑量；在建立了可靠的轉(zhuǎn)運(yùn)模型和確保受試物對Caco-2細(xì)胞單層無顯著毒性的前提下，應(yīng)用Caco-2單層模型對受試物進(jìn)行了雙向轉(zhuǎn)運(yùn)研究（腸腔側(cè)向腸壁側(cè)，AP→BL；腸壁側(cè)向腸腔側(cè)，BL→AP），考察了轉(zhuǎn)運(yùn)時間（60min-180min）和藥物濃度（50μM-200μM）對轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。然后，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定并計算受試物在滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型中的Papp。AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)據(jù)表明，紅景天苷（Papp=0.85±0.12×10~(-6)cm·s~(-1)）、洛塞琳（Papp=0.61±0.10×10~(-6)cm·s~(-1)）和絡(luò)薩維（Papp=0.74±0.12×10~(-6)cm·s~(-1)）均為難吸收（PappAP→BL1×10~(-6)cm·s~(-1)）藥物。紅景天苷的苷元酪醇（Papp=1.52±0.16×10~(-6)cm·s~(-1)）滲透性要好于紅景天苷。濃度為200μM時輻射防護(hù)活性成分的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)據(jù)未表現(xiàn)出明顯方向性（0.61×10~(-6)cm·s~(-1)PappBL→AP/PappAP→BL1.52×10~(-6)cm·s~(-1)），且轉(zhuǎn)運(yùn)隨藥物濃度、作用時間呈依賴性動態(tài)變化，提示紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，紅景天苷BL向AP方向轉(zhuǎn)運(yùn)大于AP向BL方向，提示其轉(zhuǎn)運(yùn)過程可能存在外排現(xiàn)象，這也可能是造成其吸收性較差的原因。 綜上所述，紅景天中的苷（苷元）類化學(xué)成分從不同方面均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。其中，紅景天苷、酪醇、洛塞琳、絡(luò)薩維和肉桂醇表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力。在淋巴細(xì)胞損傷模型中，異槲皮苷、紅景天苷、絡(luò)薩維、洛塞琳、熊果苷和酪醇均能夠顯著提高輻射損傷的AHH-1細(xì)胞的活力。兩部分篩選結(jié)果提示紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維可能為紅景天中的抗輻射活性成分。在Caco-2單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)研究中發(fā)現(xiàn)，紅景天苷、洛塞琳和絡(luò)薩維均為難吸收藥物；而作為紅景天苷的苷元-酪醇，其吸收性優(yōu)于紅景天苷。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R285;R85

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 程贏;黃越承;高福;李百龍;崔建國;蔡建明;孫權(quán);;富勒烯賴氨酸衍生物對AHH-1細(xì)胞防護(hù)效應(yīng)研究[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報;2010年05期

2 曾滿紅;黃清松;張德興;;紅景天總黃酮對自然衰老大鼠抗氧化和免疫功能的影響[J];解剖學(xué)研究;2012年02期

3 陸峰,肖杰,林培英,楊根金;褶合光譜法考察羥自由基清除劑對紫外照射致DNA變異的作用[J];光譜學(xué)與光譜分析;2004年01期

4 程安瑋;王文亮;陳相艷;徐同成;弓志青;靳瓊;;紅景天多酚的提取及抗氧化活性研究[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年09期

本文編號：1244416