本文關(guān)鍵詞：氮芥介導(dǎo)下的烷基轉(zhuǎn)移酶MGMT與DNA的交聯(lián)作用及其修復(fù)過(guò)程的研究

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【摘要】：研究背景芥類(lèi)毒劑是一類(lèi)重要的軍用糜爛性毒劑,對(duì)皮膚、眼及呼吸道等有嚴(yán)重的致傷作用,其中呼吸道損傷是傷芥類(lèi)毒劑損傷中最為難防難治且有明顯的遠(yuǎn)后效應(yīng)的。糜爛性毒劑氮芥是雙功能烷化劑的一種,其分子內(nèi)含有兩個(gè)烴基,因而可分別與DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng),形成了共價(jià)穩(wěn)定的DNA-蛋白交聯(lián)(DNA-protein crossslink,DPC)。DPC是DNA損傷的一種形式,因其產(chǎn)生的巨大復(fù)雜的空間阻隔妨礙DNA的解旋和復(fù)制,產(chǎn)生基因毒作用和細(xì)胞毒作用。O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)能獨(dú)立移除O6位點(diǎn)加合物,從而修復(fù)烷化劑引起的DNA損傷,在DNA直接修復(fù)途徑中扮演著極為關(guān)鍵的作用。然而,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MGMT對(duì)氮芥等雙功能烷化劑引起的損傷修復(fù)不佳,原因在于此類(lèi)烷化劑能分別以其兩個(gè)烷化位點(diǎn)結(jié)合DNA及MGMT,形成MGMT-DNA交聯(lián)(m DPC),從而使MGMT由DNA損傷修復(fù)酶轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)DNA損傷的因子。DPC有多種修復(fù)方式,在高等真核細(xì)胞中較被重視的是同源重組(homologous recombination,HR)及新近報(bào)道的蛋白水解�，F(xiàn)階段,對(duì)氮芥介導(dǎo)的mDPC損傷效應(yīng)、形成的影響尚無(wú)完全清晰的研究,而針對(duì)氮芥引起的m DPC的修復(fù)則尚未見(jiàn)報(bào)道。研究?jī)?nèi)容1.研究氮芥的損傷效應(yīng):以人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cell,16HBE)為模型,研究氮芥鹽酸鹽(mechlorethamine,也叫做N-methyl-2,2-di(chloroethyl)amine,HN2)染毒后細(xì)胞活力變化;在維持適宜細(xì)胞活力的染毒濃度條件下,研究HN2對(duì)DNA的損傷效應(yīng),以及誘導(dǎo)DPC形成的效應(yīng),并重點(diǎn)關(guān)注MGMT-DNA交聯(lián)物(mDPC)的形成及其劑量依賴(lài)效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。2.從MGMT表達(dá)量的角度,研究HN2介導(dǎo)形成mDPC的影響因素:利用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子c-MYC調(diào)控MGMT蛋白的表達(dá)水平,利用特異性抑制劑消耗MGMT,降低其蛋白水平,觀察對(duì)mDPC及細(xì)胞中總DPC(total-DPC,tDPC)形成量的影響。3.研究m DPC的修復(fù)方式:觀察細(xì)胞染后毒多種DNA損傷修復(fù)通路的激活情況及其時(shí)間效應(yīng);觀察蛋白水解對(duì)dpc修復(fù)的影響,并重點(diǎn)關(guān)注在蛋白水解通路中新預(yù)測(cè)的蛋白dvc1在染毒后的表達(dá)情況、對(duì)dpc和mdpc的修復(fù)作用及其影響因素;初步探討dvc1的分子功能;研究mgmt表達(dá)水平及mdpc水平對(duì)dvc1的影響。4.研究mgmt的降解途徑:研究hn2染毒后mgmt是否通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解、降解過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制并闡明其時(shí)間依賴(lài)效應(yīng);研究泛素化對(duì)mdpc及tdpc降解(修復(fù))過(guò)程的影響以及不同泛素化階段對(duì)修復(fù)過(guò)程的作用差異。研究結(jié)果1.hn2染毒16hbe細(xì)胞后,細(xì)胞活力下降,存在劑量依賴(lài)效應(yīng),并在50μm染毒濃度時(shí)下降至正常活力80%。hn2染毒引起雙鏈斷裂(doublestrandbreak,dsb),表現(xiàn)為h2ax、nf-κbmrna及磷酸化蛋白表達(dá)增加。mgmtmrna及蛋白水平在染毒后呈下降趨勢(shì)。染毒引起tdpc及mdpc含量顯著上升,mdpc形成量呈劑量依賴(lài)性升高。mdpc及tdpc含量在時(shí)間上存在染毒后1h明顯升高、6h短暫部分回落、24h重新升高的趨勢(shì)。sirna干擾mgmt蛋白表達(dá)將抑制mdpc的形成。2.未染毒的情況下,sirna干擾mgmt表達(dá)后,γ-h2ax的表達(dá)明顯上升。但在染毒后,mgmt缺失細(xì)胞其γ-h2ax的升高程度低于mgmt正常表達(dá)細(xì)胞,表現(xiàn)出dsb損傷程度降低。染毒對(duì)mgmt轉(zhuǎn)錄負(fù)向調(diào)控因子c-myc的mrna及蛋白表達(dá)無(wú)影響。c-myc特異性抑制劑10058-f4處理細(xì)胞能明顯升高mgmt的表達(dá),但在染毒后,mgmt的升高水平會(huì)被逆轉(zhuǎn)。抑制c-myc合并染毒使-h2ax、mdpc含量升高,但對(duì)tdpc含量影響不明顯。mgmt特異性底物o6bg能降低mdpc的形成,但短暫處理則會(huì)代償性增加mdpc的含量。3.hr相關(guān)基因fancd2、brca2及rad51mrna在染毒后均發(fā)生上調(diào),其中fancd2蛋白在染毒后1-6h也升高,而rad51蛋白表現(xiàn)不明顯。細(xì)胞周期及dna損傷相關(guān)chk2mrna在染毒后也升高。其余損傷修復(fù)通路的改變不明顯。蛋白酶體抑制劑mg132處理后tdpc及mdpc含量均升高。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的高等真核細(xì)胞中蛋白水解通路相關(guān)蛋白dvc1mrna及蛋白在染毒后表達(dá)均上調(diào),且dvc1缺失后mdpc形成增加、tdpc修復(fù)速率降低。dvc1具有20s蛋白酶體活力,且其修復(fù)作用是p97依賴(lài)的。細(xì)胞mgmt水平的降低會(huì)使dvc1的表達(dá)下降。4.mgmt在染毒后以原型及泛素化形式存在。mgmt的泛素化隨染毒后時(shí)間延長(zhǎng)而增加。mgmt同時(shí)存在小泛素樣化(smallubiquitin-likemodifiers,sumo),sumo化隨染毒后時(shí)間延長(zhǎng)而減輕,與泛素化相反。蛋白酶體抑制后泛素化mgmt含量升高,而e1泛素激活酶抑制后泛素化mgmt含量降低。dvc1缺失表現(xiàn)出類(lèi)似蛋白酶體抑制的結(jié)果。E1、E2、E3泛素酶抑制劑處理后t DPC修復(fù)速率降低,且E2、E3抑制劑的影響強(qiáng)于E1抑制劑。三種泛素酶抑制同樣影響mDPC的修復(fù)速率,但E1抑制后影響更強(qiáng)。研究結(jié)論HN2能造成明顯的細(xì)胞損傷及DNA損傷,促進(jìn)DPC的形成,并優(yōu)勢(shì)地交聯(lián)MGMT。m DPC的形成受HN2及MGMT含量的影響。HN2染毒能夠激活HR修復(fù)途徑中的相關(guān)因子,但未見(jiàn)其他DNA損傷修復(fù)途徑的激活。在修復(fù)HN2引起的DPC時(shí),蛋白水解參與其中,且DVC1是蛋白水解途徑修復(fù)DPC的一個(gè)重要蛋白,具有20S蛋白酶體活性,對(duì)mDPC及t DPC的修復(fù)有著重要作用。DVC1對(duì)mDPC的修復(fù)作用是依賴(lài)p97的。m DPC的修復(fù)重點(diǎn)是MGMT的降解。MGMT通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,其泛素化程度隨染毒后時(shí)間延長(zhǎng)而增加,并依賴(lài)SUMO化的呈遞,與SUMO化水平呈互補(bǔ)平衡。抑制泛素化將明顯降低t DPC及mDPC的清除速率。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R82

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本文編號(hào)：1213227