本文關(guān)鍵詞：力學(xué)環(huán)境下天然骨組織體外三維培養(yǎng)的研究

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【摘要】：研究背景和目的： 用骨組織工程技術(shù)構(gòu)建的人工骨在臨床治療中能對骨折和骨損傷病人能夠起到修復(fù)和置換的作用，使其在體內(nèi)能夠部分或短期地代替患者原有骨的功能、維持基本的骨形態(tài)，然而，這種有生命的人工骨的生物活性、與機(jī)體天然骨的相容性、排異反應(yīng)等諸多問題一直都沒有解決，影響著人工骨研究的發(fā)展進(jìn)程。因此，有必要首先對機(jī)體內(nèi)的天然骨的結(jié)構(gòu)、組成及其生長環(huán)境進(jìn)行充分研究，利用天然骨的構(gòu)成及生長的相關(guān)研究成果來開展骨組織工程的研究將會更有目的性和導(dǎo)向性。目前國內(nèi)外就此方面的研究一致認(rèn)為，骨是一種有生命的生物材料，又是能進(jìn)行新陳代謝且具有重建行為的生物組織。這種活性組織在體內(nèi)的生長和構(gòu)建受力學(xué)因素作用明顯。早在19世紀(jì)，Julis wolff就提出外部應(yīng)力能影響骨的形狀與結(jié)構(gòu)；越來越多的研究也顯示，骨組織的形狀、骨量及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化取決于骨所處的應(yīng)力環(huán)境的改變，在外來應(yīng)力刺激下，其能自動地進(jìn)行骨組織的聚集與吸收，形成完美的自控反饋系統(tǒng)，而其他的非生物力學(xué)因素則起輔助調(diào)控作用。然而，在機(jī)體內(nèi)部對骨的力學(xué)環(huán)境研究受其它因素影響較多，因此，若能在體外制備骨生長的模型，并建立有效的力學(xué)培養(yǎng)環(huán)境，將有利于開展骨的生物力學(xué)研究；但至今，這方面的研究工作并不多見，而且難度也非常大。本項(xiàng)目以來自兔股骨頭松質(zhì)骨制備的骨組織體外模型進(jìn)行體外力學(xué)刺激實(shí)驗(yàn)，目的是探討在體外培養(yǎng)環(huán)境下，力學(xué)刺激對三維培養(yǎng)的骨組織及其內(nèi)部相關(guān)骨細(xì)胞生長的影響，以便在組織層面對應(yīng)力環(huán)境與骨生長的關(guān)系進(jìn)行研究。 研究方法： 1．摘取3月齡新西蘭大白兔的股骨，無菌處理后將股骨頭的松質(zhì)骨部分制備成直徑為8mm，厚度為3mm的質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型； 2．將制備好的松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型放入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，用本室設(shè)計的力學(xué)負(fù)載和循環(huán)灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)3d、5d和7d后對其進(jìn)行HE染色和電鏡掃描，并和未培養(yǎng)的骨組織模型進(jìn)行比較，評價模型在體外生長情況； 3．利用Micro-CT對骨組織模型進(jìn)行掃描及用Mimics、Gemagic等軟件進(jìn)行模型的3D重建，并用有限元分析軟件分析表觀應(yīng)力1000με、2000με和3000με對模型內(nèi)部的影響作用；然后結(jié)合骨組織在體內(nèi)的生理應(yīng)力作用情況及本課題組的前期研究結(jié)果，用動態(tài)負(fù)載和灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的松質(zhì)骨模型實(shí)施了1000με、2000με、3000με和4000με，頻率為1Hz的表觀應(yīng)力刺激； 4．分別在表觀應(yīng)力刺激5d和14d后，檢測不同強(qiáng)度刺激組的堿性磷酸酶(AKP)的活性，并分析不同強(qiáng)度的表觀應(yīng)力刺激對松質(zhì)骨內(nèi)成骨細(xì)胞生長的影響作用； 5．根據(jù)成骨細(xì)胞內(nèi)AKP活性表達(dá)情況，分別設(shè)定1000με和2000με表觀應(yīng)力為力學(xué)負(fù)載組進(jìn)行松質(zhì)骨模型體外生長試驗(yàn)，然后用Instron5865力學(xué)性能測試機(jī)對其進(jìn)行力學(xué)性能檢測；用Micro-CT掃描對其進(jìn)行骨密度（TMD）檢測；依據(jù)Von-kossa染色試驗(yàn)和四環(huán)素鈣黃綠素雙標(biāo)記試驗(yàn)評價力學(xué)刺激對新骨形成的影響；用ELISA、Western blot和qRT-PCR分別檢測Collagen-I、OPG和BMP-2蛋白和基因在不同刺激組的表達(dá)變化； 6．檢測不同強(qiáng)度力學(xué)刺激對骨組織模型破骨細(xì)胞內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性表達(dá)的影響；分別在3000με和4000με，，頻率為1Hz的表觀應(yīng)力刺激下，用DNALadder試驗(yàn)檢測骨組織模型細(xì)胞內(nèi)DNA的變化，用Caspase活性試劑盒分別檢測Caspase-3/8/9的活性。 結(jié)果： 1．制備好的松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型經(jīng)過修剪、去脂肪組織后，直徑為8mm，厚度為3mm，大小均勻，表面平整，適合在動態(tài)力學(xué)負(fù)載系統(tǒng)上進(jìn)行力學(xué)環(huán)境下培養(yǎng)； 2．用力學(xué)負(fù)載和循環(huán)灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)培養(yǎng)制備好的松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型能夠保證培養(yǎng)體上下各個面接受到均勻的培養(yǎng)基營養(yǎng)供應(yīng)，分別培養(yǎng)3d、5d和7d后經(jīng)過HE染色和掃描電鏡檢測顯示，模型內(nèi)活細(xì)胞形態(tài)明顯，且分布密集，在細(xì)胞分布和形態(tài)上與未培養(yǎng)組無明顯區(qū)別； 3．松質(zhì)骨培養(yǎng)模型經(jīng)Micro-CT掃描后可以看見清晰的組織結(jié)構(gòu)，完整密集，而通過對重建的3D模型有限元分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模型受到3000με的表觀應(yīng)力作用時，模型內(nèi)超過4000με的節(jié)點(diǎn)數(shù)明顯增加（1600個），而低于2000με的表觀應(yīng)力作用時，其內(nèi)部多數(shù)節(jié)點(diǎn)受力保持在3000με以下； 4．經(jīng)過5d和14d的表觀應(yīng)力刺激培養(yǎng)，骨組織模型的AKP活性表達(dá)分別為27.350±0.071（控制組）、26.309±0.034U/gprot、28.121±0.212U/gprot、13.365±0.105U/gprot、10.161±0.121U/gprot和26.126±0.013U/gpro（t控制組）、29.181±0.041U/gprot、33.218±0.034U/gprot、11.151±0.108U/gprot、10.603±0.010U/gprot；分析顯示，AKP活性在表觀應(yīng)力為1000με和2000με間呈遞增趨勢，而在3000με和4000με間呈遞減趨勢； 5．在初步檢測骨組織模型AKP活性基礎(chǔ)之上，分別在培養(yǎng)14d和21d后，表觀應(yīng)力為1000με、2000με及未刺激組的其它檢測結(jié)果是：彈性模量和最大受力負(fù)荷呈刺激強(qiáng)度和刺激時間遞增，并且與未刺激組相比，2000με能顯著增加模型的彈性模量和最大受力負(fù)荷，而1000με刺激時也已使模型的最大負(fù)荷發(fā)生顯著變化；骨密度檢測結(jié)果為模型培養(yǎng)21d后，刺激組的TMD都發(fā)生了顯著增加，而培養(yǎng)14d則不能明顯改善其骨密度；Von-kossa染色和鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)記試驗(yàn)結(jié)果顯示，力學(xué)負(fù)載刺激能促進(jìn)新的類骨質(zhì)形成，并隨著負(fù)載強(qiáng)度和培養(yǎng)時間的增加，新生類骨質(zhì)的生成也呈顯著性增加，但Von-kossa染色和鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)記的試驗(yàn)結(jié)果并未呈等量增加，顯示出兩種方法間又有一定的區(qū)別；分別對Collagen-I、OPG和BMP-2蛋白和基因表達(dá)的檢測結(jié)果顯示，三者都隨刺激強(qiáng)度和時間增加呈依賴性，但在蛋白和基因?qū)哟蔚谋磉_(dá)規(guī)律又不完全一致; 6．分別經(jīng)1000με、2000με、3000με和4000με表觀應(yīng)力刺激5d后，骨組織模型破骨細(xì)胞內(nèi)TRAP活性變化結(jié)果分別為19.261±0.103（控制組）、18.911±0.081、18.126±0.134、15.961±0.089和16.023±0.101；而在3000με和4000με刺激下，DNA Ladder結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)DNA表達(dá)為明顯的梯形條帶，呈180-200bp大��；Caspase-3/8/9活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3000με和4000με表觀應(yīng)力都能顯著增強(qiáng)三者的表達(dá)活性。 結(jié)論： 1.在無菌條件下，采用三月齡新西蘭大白兔股骨頭松質(zhì)骨制備的骨組織體外培養(yǎng)模型，結(jié)構(gòu)和大小能夠保持一致，適于用力學(xué)負(fù)載和循環(huán)灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)； 2.通過Micro-CT對松質(zhì)骨體外培養(yǎng)模型的掃描可以對其進(jìn)行3D模型的重建及有限元分析，后者從理論上分析了模型在不同力學(xué)強(qiáng)度刺激作用下，其內(nèi)部的應(yīng)力分布及結(jié)構(gòu)變化，從而為探討該骨組織模型實(shí)體在體外合適力學(xué)環(huán)境的培養(yǎng)奠定了理論基礎(chǔ)； 3.通過對不同表觀應(yīng)力（1000με、2000με、3000με和4000με）刺激作用下骨組織體外培養(yǎng)模型內(nèi)AKP和TRAP的檢測分析，以及一系列的力學(xué)性能、TMD、新骨形成、分子表達(dá)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)評價，初步認(rèn)為體外培養(yǎng)該模型時，低強(qiáng)度（1000με和2000με）力學(xué)刺激可能會促進(jìn)其內(nèi)部的骨組織生長，并呈劑量和時間的依賴性；相反，高強(qiáng)度（3000με和4000με）的力學(xué)刺激則抑制了其內(nèi)部細(xì)胞（Osteoblasts和Osteoclasts）的增殖和分化，這可能與高強(qiáng)度的力學(xué)刺激引起其內(nèi)部細(xì)胞凋亡有關(guān)。 4.該骨組織模型的成功制備及體外力學(xué)環(huán)境的培養(yǎng)是骨的體外細(xì)胞培養(yǎng)研究與體內(nèi)整體研究的有效橋梁，對深入研究骨生長及發(fā)育與力學(xué)環(huán)境之間的關(guān)系具有基本的平臺作用。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R82

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙紅斌;呂同德;馬敬;馬慧;張西正;;機(jī)械力對間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的力學(xué)響應(yīng)機(jī)制研究[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2007年07期

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1 劉璐;組織工程化培養(yǎng)模型下力學(xué)載荷與植物雌激素聯(lián)合調(diào)控小鼠前成骨細(xì)胞及骨重建機(jī)制的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

本文編號：1159152