本文關(guān)鍵詞：模擬失重對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】： 中長期載人航天飛行中的失重環(huán)境會對機(jī)體心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響,主要表現(xiàn)為運(yùn)動耐力及立位耐力降低,嚴(yán)重影響航天員的健康及航天任務(wù)的完成。研究表明,失重后立位耐力不良的發(fā)生機(jī)理可能與失重后血容量減少、壓力反射敏感性降低、靜脈順應(yīng)性下降及肌肉萎縮等因素有關(guān),但其確切發(fā)生機(jī)制仍不清楚。目前認(rèn)為,失重后立位耐力不良的發(fā)生涉及多重復(fù)雜機(jī)制,不論在人體實(shí)驗(yàn)中,還是在動物實(shí)驗(yàn)中,多家實(shí)驗(yàn)室均發(fā)現(xiàn)血管系統(tǒng)的變化可能是導(dǎo)致心血管失調(diào)的重要因素。血管收縮功能不良在失重后立位耐力降低的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用,但這種血管低反應(yīng)性的確切機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。 內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體血管的內(nèi)表面,相互之間密切聯(lián)系而形成一層天然的物理屏障,從而維持著血管壁的完整性。由于其在血管壁中的特殊位置,故內(nèi)皮細(xì)胞可以對局部血管的血壓、氧分壓及血流變化迅速作出反應(yīng),通過合成和分泌多種血管活性物質(zhì)作用于血管平滑肌,從而調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮。一氧化氮(NO)可由體內(nèi)多種組織細(xì)胞分泌,作為一種內(nèi)源性的細(xì)胞內(nèi)信使分子在體內(nèi)多種生物學(xué)過程中擔(dān)當(dāng)重要角色,尤其在心血管功能的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。機(jī)體的NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的,目前發(fā)現(xiàn)的NOS有三種同工酶:神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。nNOS和eNOS可在體內(nèi)持續(xù)表達(dá),主要參與生理水平NO的調(diào)節(jié);而iNOS在生理狀態(tài)下不表達(dá),當(dāng)誘導(dǎo)因素使其表達(dá)后,會持續(xù)釋放大量的NO,產(chǎn)生一系列生理及病理作用。有報道指出內(nèi)皮細(xì)胞對失重刺激具有高度敏感性,表現(xiàn)為失重或模擬失重環(huán)境下,內(nèi)皮細(xì)胞可發(fā)生形態(tài)及基因表達(dá)的改變。大量的研究證明,尾吊模擬失重后大鼠機(jī)體NOS的活性增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),尾吊模擬失重可致大鼠股動脈等多種血管系統(tǒng)中出現(xiàn)iNOS的活性及表達(dá)量的增高,并且認(rèn)為失重或模擬失重后內(nèi)皮細(xì)胞釋放的大量非生理濃度的NO是航天后機(jī)體血管收縮不良的重要原因。然而,失重或模擬失重導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS表達(dá)變化及其調(diào)控機(jī)制尚未見報道。為了探討上述問題,我們以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,觀察了回轉(zhuǎn)器模擬失重致HUVEC-C iNOS的表達(dá)變化,進(jìn)而探討了其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究主要結(jié)果與發(fā)現(xiàn)如下: 1.模擬失重對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-C iNOS表達(dá)的影響本研究觀察了回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-C iNOS表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):地面靜止對照組與垂直旋轉(zhuǎn)對照組iNOS mRNA及蛋白表達(dá)均較低,而24 h回轉(zhuǎn)器模擬失重后,HUVEC-C iNOS mRNA及蛋白表達(dá)量顯著增高,表明24 h模擬失重可致HUVEC-C iNOS mRNA和蛋白出現(xiàn)異常表達(dá)。轉(zhuǎn)染了含有7233 bp的iNOS啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng)phiNOS(7.2)Luc HUVEC-C在模擬失重24 h后,熒光素酶相對活性約為1G對照組的2.29倍,表明回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h可致HUVEC-C iNOS在轉(zhuǎn)錄水平被激活。 2.模擬失重對HUVEC-C NF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響本研究利用HUVEC-C轉(zhuǎn)染NF-κB及AP-1報告基因的方法,觀察了回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h對HUVEC-C轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h與1G對照組相比,模擬失重可顯著抑制NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性,抑制率為48%;以同樣的方法發(fā)現(xiàn),回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h與1G對照組相比可顯著抑制AP-1依賴的轉(zhuǎn)錄活性,抑制率為38%。而兩組的陰性對照質(zhì)粒pCIS-CK轉(zhuǎn)染HUVEC-C后,回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h與地面1G對照組的熒光素酶相對活性相比無顯著差別,表明回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h可使HUVEC-C中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。 3.模擬失重致HUVEC-C iNOS異常表達(dá)機(jī)制的研究本研究通過改變轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的活性,觀察了模擬失重24 h后HUVEC-C iNOS表達(dá)的變化,進(jìn)而明確回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h HUVEC-C iNOS異常表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):應(yīng)用50μM NF-κB阻斷劑PDTC后模擬失重24 h,HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)染熒光素酶啟動子報告基因的相對熒光量與單純模擬失重組相比未見顯著變化,提示NF-κB未參與模擬失重環(huán)境下HUVEC-C iNOS的異常表達(dá)調(diào)控。應(yīng)用20μM AP-1特異阻斷劑SP600125后與單純模擬失重組相比,HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白及轉(zhuǎn)染了phiNOS(7.2)Luc的相對熒光量均出現(xiàn)顯著升高,而過表達(dá)AP-1后,與單純模擬失重組相比HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白表達(dá)及相對熒光活性均出現(xiàn)明顯抑制。以上結(jié)果提示,模擬失重24 h所致的HUVEC-C iNOS表達(dá)的增高部分地與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性降低有關(guān),而非NF-κB在起作用。 4.模擬失重致HUVEC-C iNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)合區(qū)域研究本研究利用構(gòu)建的不同截短長度的iNOS啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng),通過觀察回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h后轉(zhuǎn)染了各片段的HUVEC-C相對熒光量的變化,從而明確模擬失重24 h致HUVEC-C iNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子在iNOS啟動子上游結(jié)合作用區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染了phiNOS(0.6)Luc和phiNOS(1.0)Luc HUVEC-C在模擬失重24 h后,HUVEC-C細(xì)胞的熒光素酶活性與1G對照組相比無顯著差別,表明iNOS啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000 bp內(nèi)無回轉(zhuǎn)器模擬失重24 h誘發(fā)iNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 總之,本研究利用細(xì)胞回轉(zhuǎn)器模擬失重效應(yīng),觀察了模擬失重24 h及1G重力環(huán)境下HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白和啟動子激活水平的變化,進(jìn)而探討了模擬失重致HUVEC-C iNOS異常表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。得出了如下結(jié)論:模擬失重24 h可致HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白異常表達(dá)及在轉(zhuǎn)錄水平被激活;模擬失重24 h可降低HUVEC-C轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的轉(zhuǎn)錄活性;模擬失重24 h導(dǎo)致的HUVEC-C iNOS異常表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的轉(zhuǎn)錄活性降低有關(guān),而與NF-κB的活性降低無關(guān);iNOS啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000 bp范圍內(nèi)無模擬失重24 h誘發(fā)HUVEC-C iNOS異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。本研究結(jié)果有助于深化對失重致血管功能變化機(jī)制的認(rèn)識,對失重致立位耐力不良的防護(hù)提供新的思路和理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：模擬失重 內(nèi)皮細(xì)胞 iNOS NF-κB AP-1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R85
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-46
• 正文46-105
• 實(shí)驗(yàn)一 模擬失重24 h對HUVEC-C iNOS表達(dá)的影響46-66
• 1 引言46-47
• 2 方法47-59
• 3 結(jié)果59-63
• 4 討論63-66
• 實(shí)驗(yàn)二 模擬失重24 h對HUVEC-C NF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響66-77
• 1 引言66-67
• 2 方法67-70
• 3 結(jié)果70-73
• 4 討論73-77
• 實(shí)驗(yàn)三 模擬失重24 h上調(diào)HUVEC-C iNOS表達(dá)的機(jī)制研究77-88
• 1 引言77-78
• 2 方法78-80
• 3 結(jié)果80-83
• 4 討論83-88
• 實(shí)驗(yàn)四 模擬失重致HUVEC-C iNOS異常表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)合區(qū)域研究88-105
• 1 引言88-89
• 2 方法89-97
• 3 結(jié)果97-100
• 4 討論100-105
• 小結(jié)105-107
• 參考文獻(xiàn)107-122
• 個人簡歷和研究成果122-123
• 致謝123

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1094791