發(fā)布時(shí)間：2017-10-22 11:12

  本文關(guān)鍵詞：缺氧與NaCN中毒大鼠肺損傷特點(diǎn)及其機(jī)制初步研究

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【摘要】： 氫氰酸是極為重要的工業(yè)毒物,也是外軍裝備的速殺性化學(xué)戰(zhàn)劑,《禁止化學(xué)武器公約》將其列為“雙用途毒劑”。分子結(jié)構(gòu)中含有氰根(CN-)的化合物多具有強(qiáng)烈毒性,人們稱它們?yōu)榍桀惗緞┗蚯杌�。氰化物進(jìn)入機(jī)體后迅速釋放出氰離子(CN-),CN-對細(xì)胞呼吸鏈有很強(qiáng)的親和力,可與細(xì)胞色素氧化酶的三價(jià)鐵(Fe3+)結(jié)合,抑制該酶的活性[1],阻斷呼吸鏈電子傳遞,造成“內(nèi)呼吸”障礙。呼吸衰竭和心血管功能衰竭是氰化物中毒死亡的主要原因[2,20]。高原地區(qū)空氣稀薄,大氣壓和氧分壓降低,是高原環(huán)境對機(jī)體影響的主要因素。缺氧既可以造成機(jī)體功能的異常反應(yīng)[3],也可以加重化學(xué)毒物對腦、心、肺功能的損傷作用[4]。初入高原人員若發(fā)生氰化物中毒,機(jī)體將同時(shí)遭受呼吸性缺氧和細(xì)胞性缺氧雙重打擊,目前對缺氧條件下氰化物中毒的傷情特點(diǎn)了解甚少。 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell TypeⅡ,AECⅡ)是一種多功能細(xì)胞,對維持肺泡的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn),肺組織對缺血、缺氧損傷敏感。其中肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的位置比較特殊,容易受到來自空氣和血液兩方面的損害。因此,AECⅡ在急性肺損傷后的變化非常復(fù)雜。急性肺損傷(ALI)肺組織的病理變化為肺泡上皮細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡,形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,呼吸膜的完整性遭到破壞,導(dǎo)致其功能異常,主要表現(xiàn)為肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant,PS)系統(tǒng)的異常,表面活性物質(zhì)是呼吸不可缺少的物質(zhì),這種基本物質(zhì)的缺乏、不足和失活是引起嚴(yán)重呼吸功能失調(diào)的原因。近年來,隨著對急性肺損傷發(fā)病機(jī)制及防治措施研究的深入,發(fā)現(xiàn)急性肺損傷時(shí)常伴有表面活性蛋白含量的降低[43]。AECⅡ的增殖和分化不僅可以修復(fù)肺泡的正常結(jié)構(gòu),更可以有效地進(jìn)行功能上的恢復(fù),從而阻止肺損傷向ARDS發(fā)展。AECⅡ是肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞,AECⅡ細(xì)胞的凋亡在ALI的病理過程中至關(guān)重要。研究表明,細(xì)胞凋亡可發(fā)生于ALI的不同階段和時(shí)期。AECⅡ是肺部特異性細(xì)胞,有著極其重要的生理病理功能,是急性肺損傷發(fā)病過程中的重要效應(yīng)細(xì)胞,在發(fā)病早期即可出現(xiàn)異常改變,其受損的確切機(jī)制尚未完全闡明,目前研究認(rèn)為,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)異�？赡軈⑴cALI的發(fā)病機(jī)制[42]。 為了闡明缺氧復(fù)合氰化物中毒對肺損傷的特點(diǎn)及其機(jī)制,本課題以肺泡II型上皮細(xì)胞為研究目標(biāo),從缺氧與NaCN中毒對整體動物呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的影響及對離體AEC II毒性作用研究,從肺組織及AEC II結(jié)構(gòu)變化、肺血管通透性、BALF和肺組織均漿主要成分改、氧化應(yīng)激狀態(tài)變化以及AEC II合成SP-A的能力、相關(guān)凋亡基因HIF-1α和P53蛋白表達(dá)情況等方面,研究復(fù)合缺氧損傷引起AEC II功能狀態(tài)改變與急性肺損傷的關(guān)系,以進(jìn)一步明確復(fù)合缺氧損傷AEC II發(fā)生凋亡的可能機(jī)制,為缺氧和NaCN中毒后導(dǎo)致的急性肺損傷的診斷和防治提供理論依據(jù)。 方法:1:大鼠缺氧與NaCN中毒損傷模型:高原實(shí)驗(yàn)組預(yù)缺氧72h后皮下注射NaCN 3.60mg/K。利用光鏡和免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠肺組織病理損傷、SP-A活性改變以及AEC II凋亡相關(guān)基因HIF-1α和P53的表達(dá)情況;多道生理信號記錄系統(tǒng)觀察缺氧和NaCN中毒對大鼠呼吸功能的影響;生化分析測定肺血管通透性變化、BALF成分變化趨勢和肺組織。2:離體AEC II缺氧與NaCN中毒模型:觀察NaCN對AEC II的毒性作用;Western Blot測定SP-A,HIF-1α和P53蛋白表達(dá)情況;PI-3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002,P53抑制劑PFT-α對缺氧與NaCN中毒AEC II生成SP-A的干預(yù)作用。 結(jié)果: 一、缺氧與NaCN中毒動物模型 1、缺氧和氰化鈉中毒大鼠肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理損傷,肺泡間質(zhì)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變,并出現(xiàn)變性損傷。缺氧和氰化鈉中毒大鼠AEC II變性損傷顯著,板層體排空,細(xì)胞呈空泡狀。 2、缺氧和(或)氰化鈉中毒可誘導(dǎo)大鼠肺組織HIF-1α、P53表達(dá)增強(qiáng),SP-A表達(dá)減弱。 3、常氧大鼠NaCN中毒后肺干濕質(zhì)量比、肺體比值增加,缺氧大鼠NaCN中毒肺干濕質(zhì)量比、肺體比值在各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧對照組、缺氧對照組(P0.05)。 4、常氧NaCN中毒增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù),缺氧中毒組支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧中毒組、缺氧對照組(P0.01)。 5、常氧NaCN中毒增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量,缺氧中毒組支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧中毒組,缺氧對照組(P0.01)。 6、常氧NaCN中毒升高大鼠BALF的TPL含量,缺氧對照組TPL含量明顯高于常氧對照組,皮下注射NaCN后,TPL顯著高于缺氧對照組(P0.05)。常氧NaCN中毒后肺組織TPL含量顯著下降,缺氧對照組肺組織中TPL含量低于常氧對照組NaCN染毒后進(jìn)一步下降(P0.05)。 7、常氧大鼠NaCN中毒后肺組織伊文思藍(lán)含量先增高后逐漸恢復(fù),中毒1h左右為肺損傷高峰期。缺氧大鼠NaCN中毒后肺組織伊文思藍(lán)含量隨時(shí)間延長而遞增,各時(shí)相點(diǎn)均明顯高于常氧中毒組和缺氧對照組(P0.01)。NaCN中毒動物后BALF中LDH、ACP及AKP活性明顯增高,0.5h最高,在缺氧與NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一時(shí)相點(diǎn)明顯高于單純NaCN中毒(P0.01)。 8、NaCN中毒后肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指標(biāo)的變化幅度遠(yuǎn)大于單純NaCN中毒的效應(yīng)(P0.01)。 二、缺氧與NaCN中毒AEC II模型 1、氰化鈉對肺泡II型上皮細(xì)胞具有毒性作用。氰化鈉染毒后肺泡II型上皮細(xì)胞形態(tài)變化明顯,胞體變圓,細(xì)胞突起變短或消失,胞核形態(tài)不規(guī)則;隨著染毒劑量的增大,損傷程度明顯加重,胞漿內(nèi)出現(xiàn)中毒顆粒,細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 2、氰化鈉可顯著降低肺泡II型上皮細(xì)胞活力。染毒濃度越高,肺泡II型上皮細(xì)胞活力越低,并存在明顯的劑量依賴關(guān)系(P0.01)。 3、缺氧或(和)NaCN中毒導(dǎo)致體外培養(yǎng)肺泡II型上皮細(xì)胞SP-A表達(dá)明顯降低,在缺氧與NaCN中毒時(shí)降至最低,與單一缺氧因素作用有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)。在NaCN中毒或缺氧情況下,均可引起AEC II內(nèi)P53蛋白的表達(dá)增強(qiáng),缺氧組與NaCN中毒組有明顯差異(P 0.01)。在NaCN中毒或缺氧情況下,均可引起AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。缺氧與NaCN中毒時(shí),AEC II的HIF-1α蛋白表達(dá)為正常對照組的8.5倍(P 0.01)。 4、使用LY294002或PFT-α預(yù)處理AEC II,可以顯著的提高復(fù)合缺氧損傷SP-A含量的減少(P0.01)。兩種抑制劑同時(shí)作用胞內(nèi)SP-A含量是復(fù)合缺氧損傷組的428% (P0.01)。與缺氧復(fù)合損傷組相比,加入藥物L(fēng)Y294002干預(yù)的AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)降低了55%(P0.01)。加入PFT-α預(yù)處理的AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)與LY294002干預(yù)組有明顯差異(P0.01)。LY294002和PFT-α均可降低缺氧與NaCN中毒AEC II的P53蛋白的表達(dá)。與缺氧復(fù)合損傷組比較,PFT-α預(yù)處理組AEC II的P53蛋白表達(dá)降低最顯著,降低了76.7%(P0.01)。LY294002干預(yù)組降低P53蛋白的表達(dá)量22.4%( P0.01),聯(lián)合用藥組降低P53蛋白的表達(dá)量38%( P0.01)。 結(jié)論: 1、成功建立了大鼠缺氧與NaCN中毒動物模型。研究發(fā)現(xiàn),缺氧與NaCN中毒對大鼠呼吸頻率的改變表現(xiàn)為出現(xiàn)時(shí)間早,持續(xù)時(shí)間長,變化大。缺氧環(huán)境下氰化鈉中毒所造成的呼吸頻率變化比平原組嚴(yán)重而持久。提示缺氧和氰化鈉中毒對呼吸功能可能有聯(lián)合損傷效應(yīng)。病理組織檢查檢查發(fā)現(xiàn)缺氧或(和)NaCN對大鼠肺組織具有損傷作用,可使肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理改變,肺泡間質(zhì)形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變,并出現(xiàn)變性損傷。超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)AEC II變性損傷顯著,板層體排空,細(xì)胞呈空泡狀。AEC II發(fā)生形態(tài)學(xué)改變并發(fā)生變性損傷,可能是導(dǎo)致缺氧和NaCN中毒肺急性損傷的根本原因。 2、肺體比值、肺干濕質(zhì)量比、BALF中的細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白含量、總磷脂含量與肺血管通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示,缺氧或NaCN中毒均可損傷肺泡的組織結(jié)構(gòu),導(dǎo)致通透性增加,液體自血管滲入肺泡和間質(zhì)中,BALF中蛋白含量增高可能是BALF中TPL含量先增高然后隨著PS的滅活而降低,肺組織TPL下降提示肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生損傷。在缺氧與NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一時(shí)相點(diǎn)明顯高于單純NaCN中毒(P0.01) ,提示缺氧和氰化鈉中毒的毒性對大鼠肺損傷作用加強(qiáng)。 3、NaCN中毒后肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指標(biāo)的變化幅度遠(yuǎn)大于單純NaCN中毒的效應(yīng)(P0.01)。提示氧化應(yīng)激機(jī)制在缺氧復(fù)合氰化物中毒中發(fā)揮一定作用。 4、缺氧或(和)NaCN中毒導(dǎo)致體外培養(yǎng)肺泡II型上皮細(xì)胞SP-A表達(dá)明顯降低,P53蛋白、HIF-1α蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。SP-A的變化可能是BALF中總蛋白含量和總磷脂含量先升高后降低的主要原因之一。在缺氧與NaCN中毒時(shí)SP-A表達(dá)降至最低,提示兩種缺氧因素可能加重AEC II的損傷,AEC II功能損傷可能與P53、HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)有關(guān),HIF-1α可能是AEC II凋亡途徑的樞紐信號。 5、使用LY294002或(和)PFT-α預(yù)處理AEC II,可以顯著的提高復(fù)合缺氧損傷SP-A含量的減少,明顯降低AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白、P53蛋白的表達(dá)。提示缺氧和NaCN中毒AEC II功能改變可能是HIF-1α、P53介導(dǎo)的AEC II凋亡所致。
【關(guān)鍵詞】：缺氧 氰化鈉 肺泡II型上皮細(xì)胞 急性肺損傷 肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白A 缺氧誘導(dǎo)因子-1α P53
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R82
【目錄】：

• 中英文縮寫對照5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-15
• 論文正文 缺氧與NaCN 中毒大鼠肺損傷特點(diǎn)及其機(jī)制初步研究15-105
• 前言15-17
• 第一部分 缺氧與NaCN 中毒對大鼠肺的損傷作用研究17-62
• 第一節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對大鼠肺結(jié)構(gòu)及功能的影響18-33
• 材料與方法18-22
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-32
• 小結(jié)32-33
• 第二節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對大鼠肺血管通透性及BALF 成分的影響33-47
• 材料與方法33-38
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-46
• 小結(jié)46-47
• 第三節(jié) 缺氧與NaCN 中毒大鼠呼吸系統(tǒng)氧自由基的變化47-56
• 材料與方法47-50
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-55
• 小結(jié)55-56
• 討論56-62
• 第二部分 缺氧與NaCN 中毒對大鼠AEC II 損傷的機(jī)制研究62-90
• 第一節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對原代AEC II 毒性作用的特點(diǎn)63-71
• 材料與方法63-68
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-70
• 小結(jié)70-71
• 第二節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對體外培養(yǎng)AEC II 合成SP-A 功能的影響71-83
• 材料與方法71-78
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果78-82
• 小結(jié)82-83
• 第三節(jié) LY294002 和PFT-α對AEC II 缺氧復(fù)合損傷的保護(hù)作用研究83-90
• 材料與方法83-85
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果85-89
• 小結(jié)89-90
• 討論90-96
• 全文總結(jié)96-98
• 致謝98-99
• 參考文獻(xiàn)99-105
• 文獻(xiàn)綜述 缺氧對線粒體損傷機(jī)制研究進(jìn)展105-113
• 參考文獻(xiàn)110-113
• 在讀期間發(fā)表及完成的論文113

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1078107