本文關鍵詞：缺氧與NaCN中毒大鼠肺損傷特點及其機制初步研究

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【摘要】： 氫氰酸是極為重要的工業(yè)毒物,也是外軍裝備的速殺性化學戰(zhàn)劑,《禁止化學武器公約》將其列為“雙用途毒劑”。分子結構中含有氰根(CN-)的化合物多具有強烈毒性,人們稱它們?yōu)榍桀惗緞┗蚯杌�。氰化物進入機體后迅速釋放出氰離子(CN-),CN-對細胞呼吸鏈有很強的親和力,可與細胞色素氧化酶的三價鐵(Fe3+)結合,抑制該酶的活性[1],阻斷呼吸鏈電子傳遞,造成“內(nèi)呼吸”障礙。呼吸衰竭和心血管功能衰竭是氰化物中毒死亡的主要原因[2,20]。高原地區(qū)空氣稀薄,大氣壓和氧分壓降低,是高原環(huán)境對機體影響的主要因素。缺氧既可以造成機體功能的異常反應[3],也可以加重化學毒物對腦、心、肺功能的損傷作用[4]。初入高原人員若發(fā)生氰化物中毒,機體將同時遭受呼吸性缺氧和細胞性缺氧雙重打擊,目前對缺氧條件下氰化物中毒的傷情特點了解甚少。 肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar epithelial cell TypeⅡ,AECⅡ)是一種多功能細胞,對維持肺泡的結構和功能具有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn),肺組織對缺血、缺氧損傷敏感。其中肺泡Ⅱ型上皮細胞的位置比較特殊,容易受到來自空氣和血液兩方面的損害。因此,AECⅡ在急性肺損傷后的變化非常復雜。急性肺損傷(ALI)肺組織的病理變化為肺泡上皮細胞的嚴重損傷。肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡,形態(tài)和結構發(fā)生改變,呼吸膜的完整性遭到破壞,導致其功能異常,主要表現(xiàn)為肺表面活性物質(pulmonary surfactant,PS)系統(tǒng)的異常,表面活性物質是呼吸不可缺少的物質,這種基本物質的缺乏、不足和失活是引起嚴重呼吸功能失調(diào)的原因。近年來,隨著對急性肺損傷發(fā)病機制及防治措施研究的深入,發(fā)現(xiàn)急性肺損傷時常伴有表面活性蛋白含量的降低[43]。AECⅡ的增殖和分化不僅可以修復肺泡的正常結構,更可以有效地進行功能上的恢復,從而阻止肺損傷向ARDS發(fā)展。AECⅡ是肺泡上皮細胞的干細胞,AECⅡ細胞的凋亡在ALI的病理過程中至關重要。研究表明,細胞凋亡可發(fā)生于ALI的不同階段和時期。AECⅡ是肺部特異性細胞,有著極其重要的生理病理功能,是急性肺損傷發(fā)病過程中的重要效應細胞,在發(fā)病早期即可出現(xiàn)異常改變,其受損的確切機制尚未完全闡明,目前研究認為,肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡及相關基因表達異常可能參與ALI的發(fā)病機制[42]。 為了闡明缺氧復合氰化物中毒對肺損傷的特點及其機制,本課題以肺泡II型上皮細胞為研究目標,從缺氧與NaCN中毒對整體動物呼吸系統(tǒng)結構和功能指標的影響及對離體AEC II毒性作用研究,從肺組織及AEC II結構變化、肺血管通透性、BALF和肺組織均漿主要成分改、氧化應激狀態(tài)變化以及AEC II合成SP-A的能力、相關凋亡基因HIF-1α和P53蛋白表達情況等方面,研究復合缺氧損傷引起AEC II功能狀態(tài)改變與急性肺損傷的關系,以進一步明確復合缺氧損傷AEC II發(fā)生凋亡的可能機制,為缺氧和NaCN中毒后導致的急性肺損傷的診斷和防治提供理論依據(jù)。 方法:1:大鼠缺氧與NaCN中毒損傷模型:高原實驗組預缺氧72h后皮下注射NaCN 3.60mg/K。利用光鏡和免疫組織化學方法觀察大鼠肺組織病理損傷、SP-A活性改變以及AEC II凋亡相關基因HIF-1α和P53的表達情況;多道生理信號記錄系統(tǒng)觀察缺氧和NaCN中毒對大鼠呼吸功能的影響;生化分析測定肺血管通透性變化、BALF成分變化趨勢和肺組織。2:離體AEC II缺氧與NaCN中毒模型:觀察NaCN對AEC II的毒性作用;Western Blot測定SP-A,HIF-1α和P53蛋白表達情況;PI-3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002,P53抑制劑PFT-α對缺氧與NaCN中毒AEC II生成SP-A的干預作用。 結果: 一、缺氧與NaCN中毒動物模型 1、缺氧和氰化鈉中毒大鼠肺組織結構出現(xiàn)病理損傷,肺泡間質形態(tài)學結構改變,并出現(xiàn)變性損傷。缺氧和氰化鈉中毒大鼠AEC II變性損傷顯著,板層體排空,細胞呈空泡狀。 2、缺氧和(或)氰化鈉中毒可誘導大鼠肺組織HIF-1α、P53表達增強,SP-A表達減弱。 3、常氧大鼠NaCN中毒后肺干濕質量比、肺體比值增加,缺氧大鼠NaCN中毒肺干濕質量比、肺體比值在各時相點均明顯高于常氧對照組、缺氧對照組(P0.05)。 4、常氧NaCN中毒增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞數(shù),缺氧中毒組支氣管肺泡灌洗液中細胞計數(shù)各時相點均明顯高于常氧中毒組、缺氧對照組(P0.01)。 5、常氧NaCN中毒增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量,缺氧中毒組支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量各時相點均明顯高于常氧中毒組,缺氧對照組(P0.01)。 6、常氧NaCN中毒升高大鼠BALF的TPL含量,缺氧對照組TPL含量明顯高于常氧對照組,皮下注射NaCN后,TPL顯著高于缺氧對照組(P0.05)。常氧NaCN中毒后肺組織TPL含量顯著下降,缺氧對照組肺組織中TPL含量低于常氧對照組NaCN染毒后進一步下降(P0.05)。 7、常氧大鼠NaCN中毒后肺組織伊文思藍含量先增高后逐漸恢復,中毒1h左右為肺損傷高峰期。缺氧大鼠NaCN中毒后肺組織伊文思藍含量隨時間延長而遞增,各時相點均明顯高于常氧中毒組和缺氧對照組(P0.01)。NaCN中毒動物后BALF中LDH、ACP及AKP活性明顯增高,0.5h最高,在缺氧與NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一時相點明顯高于單純NaCN中毒(P0.01)。 8、NaCN中毒后肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指標的變化幅度遠大于單純NaCN中毒的效應(P0.01)。 二、缺氧與NaCN中毒AEC II模型 1、氰化鈉對肺泡II型上皮細胞具有毒性作用。氰化鈉染毒后肺泡II型上皮細胞形態(tài)變化明顯,胞體變圓,細胞突起變短或消失,胞核形態(tài)不規(guī)則;隨著染毒劑量的增大,損傷程度明顯加重,胞漿內(nèi)出現(xiàn)中毒顆粒,細胞數(shù)量明顯減少。 2、氰化鈉可顯著降低肺泡II型上皮細胞活力。染毒濃度越高,肺泡II型上皮細胞活力越低,并存在明顯的劑量依賴關系(P0.01)。 3、缺氧或(和)NaCN中毒導致體外培養(yǎng)肺泡II型上皮細胞SP-A表達明顯降低,在缺氧與NaCN中毒時降至最低,與單一缺氧因素作用有顯著的統(tǒng)計學意義(P 0.01)。在NaCN中毒或缺氧情況下,均可引起AEC II內(nèi)P53蛋白的表達增強,缺氧組與NaCN中毒組有明顯差異(P 0.01)。在NaCN中毒或缺氧情況下,均可引起AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白的表達增強。缺氧與NaCN中毒時,AEC II的HIF-1α蛋白表達為正常對照組的8.5倍(P 0.01)。 4、使用LY294002或PFT-α預處理AEC II,可以顯著的提高復合缺氧損傷SP-A含量的減少(P0.01)。兩種抑制劑同時作用胞內(nèi)SP-A含量是復合缺氧損傷組的428% (P0.01)。與缺氧復合損傷組相比,加入藥物LY294002干預的AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白表達降低了55%(P0.01)。加入PFT-α預處理的AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白表達與LY294002干預組有明顯差異(P0.01)。LY294002和PFT-α均可降低缺氧與NaCN中毒AEC II的P53蛋白的表達。與缺氧復合損傷組比較,PFT-α預處理組AEC II的P53蛋白表達降低最顯著,降低了76.7%(P0.01)。LY294002干預組降低P53蛋白的表達量22.4%( P0.01),聯(lián)合用藥組降低P53蛋白的表達量38%( P0.01)。 結論: 1、成功建立了大鼠缺氧與NaCN中毒動物模型。研究發(fā)現(xiàn),缺氧與NaCN中毒對大鼠呼吸頻率的改變表現(xiàn)為出現(xiàn)時間早,持續(xù)時間長,變化大。缺氧環(huán)境下氰化鈉中毒所造成的呼吸頻率變化比平原組嚴重而持久。提示缺氧和氰化鈉中毒對呼吸功能可能有聯(lián)合損傷效應。病理組織檢查檢查發(fā)現(xiàn)缺氧或(和)NaCN對大鼠肺組織具有損傷作用,可使肺組織結構出現(xiàn)明顯病理改變,肺泡間質形態(tài)學結構改變,并出現(xiàn)變性損傷。超微結構檢查發(fā)現(xiàn)AEC II變性損傷顯著,板層體排空,細胞呈空泡狀。AEC II發(fā)生形態(tài)學改變并發(fā)生變性損傷,可能是導致缺氧和NaCN中毒肺急性損傷的根本原因。 2、肺體比值、肺干濕質量比、BALF中的細胞計數(shù)、總蛋白含量、總磷脂含量與肺血管通透性實驗結果均提示,缺氧或NaCN中毒均可損傷肺泡的組織結構,導致通透性增加,液體自血管滲入肺泡和間質中,BALF中蛋白含量增高可能是BALF中TPL含量先增高然后隨著PS的滅活而降低,肺組織TPL下降提示肺泡上皮細胞發(fā)生損傷。在缺氧與NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一時相點明顯高于單純NaCN中毒(P0.01) ,提示缺氧和氰化鈉中毒的毒性對大鼠肺損傷作用加強。 3、NaCN中毒后肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指標的變化幅度遠大于單純NaCN中毒的效應(P0.01)。提示氧化應激機制在缺氧復合氰化物中毒中發(fā)揮一定作用。 4、缺氧或(和)NaCN中毒導致體外培養(yǎng)肺泡II型上皮細胞SP-A表達明顯降低,P53蛋白、HIF-1α蛋白的表達增強。SP-A的變化可能是BALF中總蛋白含量和總磷脂含量先升高后降低的主要原因之一。在缺氧與NaCN中毒時SP-A表達降至最低,提示兩種缺氧因素可能加重AEC II的損傷,AEC II功能損傷可能與P53、HIF-1α表達增強有關,HIF-1α可能是AEC II凋亡途徑的樞紐信號。 5、使用LY294002或(和)PFT-α預處理AEC II,可以顯著的提高復合缺氧損傷SP-A含量的減少,明顯降低AEC II內(nèi)HIF-1α蛋白、P53蛋白的表達。提示缺氧和NaCN中毒AEC II功能改變可能是HIF-1α、P53介導的AEC II凋亡所致。
【關鍵詞】：缺氧 氰化鈉 肺泡II型上皮細胞 急性肺損傷 肺表面活性物質結合蛋白A 缺氧誘導因子-1α P53
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R82
【目錄】：

• 中英文縮寫對照5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-15
• 論文正文 缺氧與NaCN 中毒大鼠肺損傷特點及其機制初步研究15-105
• 前言15-17
• 第一部分 缺氧與NaCN 中毒對大鼠肺的損傷作用研究17-62
• 第一節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對大鼠肺結構及功能的影響18-33
• 材料與方法18-22
• 實驗結果22-32
• 小結32-33
• 第二節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對大鼠肺血管通透性及BALF 成分的影響33-47
• 材料與方法33-38
• 實驗結果38-46
• 小結46-47
• 第三節(jié) 缺氧與NaCN 中毒大鼠呼吸系統(tǒng)氧自由基的變化47-56
• 材料與方法47-50
• 實驗結果50-55
• 小結55-56
• 討論56-62
• 第二部分 缺氧與NaCN 中毒對大鼠AEC II 損傷的機制研究62-90
• 第一節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對原代AEC II 毒性作用的特點63-71
• 材料與方法63-68
• 實驗結果68-70
• 小結70-71
• 第二節(jié) 缺氧與NaCN 中毒對體外培養(yǎng)AEC II 合成SP-A 功能的影響71-83
• 材料與方法71-78
• 實驗結果78-82
• 小結82-83
• 第三節(jié) LY294002 和PFT-α對AEC II 缺氧復合損傷的保護作用研究83-90
• 材料與方法83-85
• 實驗結果85-89
• 小結89-90
• 討論90-96
• 全文總結96-98
• 致謝98-99
• 參考文獻99-105
• 文獻綜述 缺氧對線粒體損傷機制研究進展105-113
• 參考文獻110-113
• 在讀期間發(fā)表及完成的論文113

【參考文獻】

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