本文關鍵詞：模擬微重力效應對海藻酸鈉三維培養(yǎng)心肌細胞的影響

  更多相關文章： 模擬微重力效應 海藻酸鈉微囊體 細胞三維培養(yǎng) 細胞增殖 離子通道 氧化應激

【摘要】：微重力可致航天員在太空飛行過程中生理機能發(fā)生改變。這些變化主要包括心血管系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的病理性改變，其中心血管系統(tǒng)病理性改變是造成空間飛行過程中航天員不能順利完成空間作業(yè)，甚至猝死的主要原因。因此，探討微重力對心臟結構和功能的影響及其相關機制，可為進一步建立基于生物醫(yī)學基礎的有效防護措施提供理論基礎，對于保證航天員在太空飛行時的健康和有效工作具有重要意義。 由于在空間進行微重力實驗耗資大，機會有限，因此地面模擬微重力效應是目前空間生物學與航天醫(yī)學研究的主要研究方式。為了克服模擬微重力效應研究中細胞二維培養(yǎng)的不足，本研究構建了一種新型的海藻酸鈉微囊體，使細胞在該載體內(nèi)呈三維生長，以保證盡可能實現(xiàn)在體細胞的特征。為了選擇力學性能穩(wěn)定，可以對抗回轉(zhuǎn)過程產(chǎn)生的剪切力作用的載體材料，本實驗首先利用流變儀檢測了不同組成成分的海藻酸鈉微囊體力學性能，結果顯示1:30:0.05海藻酸鈉/膠原/殼聚糖為最佳組成。掃描電鏡顯示微囊體為內(nèi)部多孔結構，有利于細胞培養(yǎng)。其次，細胞增殖實驗表明心肌細胞在該微囊體內(nèi)的穩(wěn)定增殖，原代心肌細胞在微囊體內(nèi)可形成類心肌組織，并維持長期搏動。因此，海藻酸鈉/膠原/殼聚糖微囊體包覆心肌細胞可用于后續(xù)微重力效應的相關研究。 為了進一步研究海藻酸鈉微囊體用于模擬微重力效應研究的可靠性，本研究利用回轉(zhuǎn)儀以轉(zhuǎn)數(shù)15rpm回轉(zhuǎn)培養(yǎng)24hr，比較海藻酸鈉微囊體和cytodex微球為載體的心肌細胞微絲結構改變，發(fā)現(xiàn)兩者微絲結構變化相似，此外不同表型的乳腺癌細胞在海藻酸鈉微囊體中回轉(zhuǎn)培養(yǎng)48hr后，乳腺癌細胞的生物學特性發(fā)生改變，表明海藻酸鈉微囊體用于模擬微重力效應研究的可行性。 在構建以海藻酸鈉微囊體為載體的細胞三維培養(yǎng)模型基礎上，本文利用免疫熒光染色、MTT和流式細胞儀等方法研究了模擬微重力效應對心肌細胞結構、增殖和凋亡的影響，結果表明模擬微重力效應24hr導致三維培養(yǎng)的心肌細胞偽足消失，增殖能力降低，36hr出現(xiàn)早期凋亡，并在回轉(zhuǎn)培養(yǎng)72hr時出現(xiàn)DNA損傷。 為了深入研究模擬微重力效應對三維培養(yǎng)的心肌細胞功能的影響及其相應機制，本研究還分析了心肌細胞搏動頻率的變化，，通過顯微鏡觀察海藻酸鈉微囊體內(nèi)心肌細胞的搏動頻率，發(fā)現(xiàn)模擬微重力效應24hr可致原代心肌細胞收縮頻率改變，表明模擬微重力效應改變?nèi)S培養(yǎng)的心肌細胞的搏動功能。同時利用實時定量PCR和Western-blot分析了模擬微重力效應與介導興奮-收縮耦聯(lián)的縫隙連接蛋白Connexin43以及影響心肌功能的離子通道蛋白（鈉離子通道蛋白、L-鈣離子通道蛋白、鈉鉀泵、鈉氫交換體）表達變化的關系，研究結果提示模擬微重力效應對編碼鈉通道的基因SCN5a表達未造成明顯影響，而其余通道蛋白均有不同程度的表達變化（Connexin43表達呈一過性改變，可產(chǎn)生適應性恢復；L-鈣通道蛋白表達增高；鈉鉀泵和鈉氫交換體表達降低），說明模擬微重力效應改變了動作電位產(chǎn)生的分子基礎，從而導致心肌搏動功能改變。此外，尾懸吊大鼠實驗也表明模擬微重力效應改變了心肌離子通道蛋白表達，其中Connexin43和鈉氫交換體改變與體外培養(yǎng)的心肌細胞改變一致，而L-鈣通道蛋白和鈉鉀泵表達與體實驗相反，以上研究結果提示神經(jīng)體液調(diào)控參與了模擬微重力效應下心肌組織離子通道蛋白的表達。 在以上研究的基礎上，為了深入分析模擬微重力效應下線粒體氧化應激響應的協(xié)同變化，利用線粒體特異探針熒光染色、活性氧探針DCFH-DA、Rh123染色以及抗氧化酶活性檢測試劑盒研究了心肌細胞氧化應激的發(fā)生及相關機制，結果表明模擬微重力效應24hr心肌線粒體分布發(fā)生改變，48hr細胞活性氧顯著增加，線粒體膜電位改變，導致心肌處于氧化應激狀態(tài)。同時心肌細胞抗氧化物酶活性增強、熱休克蛋白和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB高表達。抗氧化物SOD活性分析表明回轉(zhuǎn)培養(yǎng)的氧化應激機制可能以超氧化物為主。此外，線粒體的氧化應激研究結果也提示氧化應激參與了心肌細胞模擬微重力效應的響應機制，而且與心肌細胞搏動變化及部分離子通道的變化具有一致性。 綜上，本研究通過構造新型海藻酸鈉微囊體，建立了適用于模擬微重力效應研究的細胞三維培養(yǎng)體系，同時通過系統(tǒng)的探討心肌細胞對空間微重力環(huán)境的響應及其功能變化，證實模擬微重力效應會導致心肌細胞骨架改變，并引起線粒體分布發(fā)生變化，活性氧顯著增加，線粒體膜電位改變，使心肌處于氧化應激狀態(tài)。同時引起縫隙連接蛋白和離子通道蛋白的表達改變，最終導致原代心肌細胞搏動功能紊亂。
【關鍵詞】：模擬微重力效應 海藻酸鈉微囊體 細胞三維培養(yǎng) 細胞增殖 離子通道 氧化應激
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R85
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 緒論13-41
• 1.1 課題研究背景和課題來源13-14
• 1.2 心臟電生理特征14-22
• 1.2.1 心肌細胞離子通道14-17
• 1.2.2 心肌電生理特性與離子流的關系17-20
• 1.2.3 心律失常的分子機制20-22
• 1.3 氧化應激對心臟功能影響22-23
• 1.4 微重力/模擬微重力效應對心臟結構和功能影響23-34
• 1.4.1 微重力/模擬微重力效應的生物學作用23-24
• 1.4.2 模擬微重力效應研究的心臟模型24-27
• 1.4.3 微重力對心臟功能及電生理的影響27-29
• 1.4.4 微重力影響心臟結構和功能的機制29-34
• 1.5 細胞三維培養(yǎng)34-38
• 1.5.1 細胞三維培養(yǎng)方法34-35
• 1.5.2 三維培養(yǎng)的優(yōu)點35-37
• 1.5.3 心肌細胞三維培養(yǎng)37-38
• 1.6 本課題的研究意義和主要研究內(nèi)容38-41
• 1.6.1 本課題的研究意義38-39
• 1.6.2 本課題的研究內(nèi)容39-41
• 第2章 實驗材料與方法41-57
• 2.1 實驗材料41-45
• 2.1.1 細胞系及實驗動物41
• 2.1.2 引物41-42
• 2.1.3 抗體42
• 2.1.4 常規(guī)試劑42-44
• 2.1.5 其它實驗試劑44
• 2.1.6 實驗儀器44-45
• 2.2 實驗方法45-56
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)45-47
• 2.2.2 鼠尾膠原的制備47
• 2.2.3 水凝膠力學分析47
• 2.2.4 液相色譜儀檢測乳酸含量47
• 2.2.5 細胞面積測量方法47
• 2.2.6 細胞增殖分析47-48
• 2.2.7 線粒體氧化應激分析48-50
• 2.2.8 細胞凋亡檢測50-51
• 2.2.9 免疫熒光標記技術51-52
• 2.2.10 心肌組織獲取和固定52
• 2.2.11 免疫雜交技術檢測蛋白表達52-53
• 2.2.12 實時定量PCR技術檢測離子通道基因的表達53-54
• 2.2.13 大鼠尾懸吊模擬微重力效應方法54
• 2.2.14 大鼠心電圖采集方法54
• 2.2.15 電子顯微鏡觀察細胞超微結構54-55
• 2.2.16 統(tǒng)計學分析55-56
• 2.3 本章小結56-57
• 第3章 三維培養(yǎng)體系的建立57-73
• 3.1 引言57
• 3.2 三維培養(yǎng)系統(tǒng)載體材料的選擇57-59
• 3.3 細胞-海藻酸鈉微囊體培養(yǎng)體系的構建59-61
• 3.4 心肌細胞在海藻酸鈉微囊體內(nèi)生長狀態(tài)分析61-71
• 3.4.1 海藻酸鈉微囊體內(nèi)心肌細胞H9c2 生長及代謝研究62-64
• 3.4.2 海藻酸鈉微囊體用于原代心肌細胞培養(yǎng)64-71
• 3.5 討論71-72
• 3.6 本章小結72-73
• 第4章 模擬微重力效應影響心肌細胞結構及增殖73-89
• 4.1 引言73
• 4.2 海藻酸鈉微囊體包覆細胞模擬微重力效應實驗體系的研究73-77
• 4.2.1 海藻酸鈉微囊體包覆細胞RCCS回轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)數(shù)研究73-74
• 4.2.2 RCCS回轉(zhuǎn)培養(yǎng)中心肌細胞微絲結構分析74
• 4.2.3 海藻酸鈉三維培養(yǎng)細胞回轉(zhuǎn)培養(yǎng)的細胞生長特性74-77
• 4.3 模擬微重力效應對心肌細胞骨架結構影響77-81
• 4.4 模擬微重力效應對心肌細胞增殖的影響81-85
• 4.4.1 模擬微重力效應抑制三維培養(yǎng)的心肌細胞的增殖81-83
• 4.4.2 模擬微重力效應導致心肌細胞凋亡83-85
• 4.5 討論85-87
• 4.6 本章小結87-89
• 第5章 模擬微重力效應對心肌細胞搏動功能影響及分子機制研究89-110
• 5.1 引言89
• 5.2 模擬微重力效應導致心肌細胞搏動改變89-90
• 5.3 模擬微重力效應對縫隙連接蛋白表達影響90-94
• 5.4 模擬微重力效應對鈉通道蛋白和L-鈣通道蛋白表達影響94-100
• 5.4.1 模擬微重力效應對鈉通道蛋白表達的影響95-97
• 5.4.2 模擬微重力效應對L-鈣通道蛋白表達的影響97-100
• 5.5 模擬微重力效應對鈉鉀泵和鈉氫交換體表達影響100-107
• 5.5.1 模擬微重力效應對鈉鉀泵表達的影響100-104
• 5.5.2 模擬微重力效應對鈉氫交換體表達的影響104-107
• 5.6 討論107-109
• 5.7 本章小結109-110
• 第6章 模擬微重力效應對心肌細胞線粒體氧化應激的研究110-123
• 6.1 引言110
• 6.2 模擬微重力效應改變心肌細胞線粒體的分布110-112
• 6.3 模擬微重力效應致心肌細胞線粒體的響應機制112-116
• 6.3.1 模擬微重力效應對心肌細胞活性氧的影響112-114
• 6.3.2 模擬微重力效應對心肌細胞線粒體膜電位的影響114-116
• 6.4 模擬微重力效應致線粒體氧化應激的調(diào)控機制116-119
• 6.5 討論119-121
• 6.6 本章小結121-123
• 結論123-125
• 參考文獻125-146
• 附錄Ⅰ146-147
• 附錄Ⅱ147-150
• 附錄Ⅲ150-151
• 附錄Ⅳ151-158
• 附錄Ⅴ158-159
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文及其它成果159-162
• 致謝162-163
• 個人簡歷163

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：1040812