本文關(guān)鍵詞：電離輻射致骨損傷遠(yuǎn)端效應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制研究

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【摘要】：[研究背景和目的]隨著腫瘤治療手段和診斷方法的進(jìn)步,腫瘤患者的生存率明顯增加。放射治療是臨床惡性腫瘤治療的一種有效的和不可缺少的方法。然而,放射治療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時可損傷正常組織,放療后骨損傷包括骨質(zhì)疏松及其骨折即是腫瘤放療的遠(yuǎn)后期效應(yīng)之一,且多數(shù)僅在發(fā)生骨折后才給予診斷,是常見的癌癥放療后遺癥,病因不明,治療手段缺乏。癌癥放療引起的骨骼并發(fā)癥己在乳腺癌、腦癌、盆腔腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤等的臨床研究中得到報道。而近年有臨床研究和動物實驗證據(jù)提示,即使是局部放療也有可能引起全身性包括非受照區(qū)域骨骼的損傷效應(yīng)即電離輻射致骨損傷遠(yuǎn)端效應(yīng)(abscopal effect)。此外,由于腹腔等局部照射使腹腔內(nèi)一些對骨代謝平衡有重要調(diào)控作用的器官如腎臟的功能發(fā)生改變,也可能是腹腔局部放療引起區(qū)域性和全身性包括非受照部位骨骼的骨密度下降、骨質(zhì)疏松和非脆性骨折發(fā)生率增加的發(fā)生機(jī)理之一。但有關(guān)局部放療引起非受照區(qū)域骨骼損傷即癌癥放療相關(guān)骨損傷遠(yuǎn)端效應(yīng)的病因機(jī)制尚不明確。本研究首先采用137Cs 7射線照射成骨細(xì)胞和。腎小管上皮細(xì)胞,同時建立細(xì)胞條件培養(yǎng)基方法、成骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系和腎小管上皮細(xì)胞-成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,觀察受照后細(xì)胞直接或/和條件培養(yǎng)基對未受照成骨細(xì)胞生物學(xué)功能,包括增殖、分化、體外礦化能力及其分化相關(guān)基因和凋亡的影響,探討電離輻射致骨損傷遠(yuǎn)端效應(yīng)及其細(xì)胞機(jī)制,有望為臨床癌癥放療相關(guān)骨損傷遠(yuǎn)端效應(yīng)的防治提供一個新的干預(yù)治療靶點和理論依據(jù)。[研究方法]取大鼠頭蓋骨分離培養(yǎng)的原代成骨細(xì)胞和大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E),傳代后給予不同劑量(0,1,2,5,10Gy)1γ射線照射,照后24h收集照射后細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ICCM)。用10%、20%濃度的照射后細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)未受照OB,相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法觀察ICCM對OB增殖的影響,PNPP偶氮法觀察ICCM對OB堿性磷酸酶(ALP)活性的影響,茜素紅(ARS)礦化結(jié)節(jié)染色并計算面積以觀察OB體外礦化能力改變,RT-PCR半定量分析ICCM對成骨細(xì)胞ALP、OPG、OC等相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響,流式細(xì)胞儀用Annexin-FITC/PI雙染法觀察ICCM致OB凋亡改變。同時,采用Transwell培養(yǎng)板建立成骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系和腎小管上皮細(xì)胞-成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,以進(jìn)一步闡明受照(IR)成骨細(xì)胞或受照(IR)。腎小管上皮細(xì)胞對未受照(NR) OB生物學(xué)功能影響及其細(xì)胞機(jī)制。經(jīng)5Gy137Cs γ射線照射后的成骨細(xì)胞或腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E,照后分別培養(yǎng)2,24,48,72h,再與未受照OB共培養(yǎng)以觀察其生物學(xué)功能的改變；并采用不同劑量137Cs γ射線(0,1,2,5,10Gy)照射成骨細(xì)胞和大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E),照后2h(OB)或72h (NRK-52E)與未受照成骨細(xì)胞共培養(yǎng),觀察未受照(NR) OB生物學(xué)功能如增殖、分化、礦化能力及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的改變,以探討電離輻射致骨損傷的間接效應(yīng)及其細(xì)胞機(jī)制。[研究結(jié)果]1. ICCM能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能,表現(xiàn)為抑制增殖和分化,引起細(xì)胞死亡或凋亡。來自受照OB的條件培養(yǎng)基可使OB發(fā)生纖維細(xì)胞形態(tài)改變,細(xì)胞突起和突起連接均減少,10%和20%濃度的10Gy ICCM均使未受照的OB增殖受到明顯抑制,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。流式細(xì)胞儀測定發(fā)現(xiàn)40%濃度ICCM時,各照射劑量ICCM培養(yǎng)的成骨細(xì)胞凋亡率均較對照組(0Gy)高；10%濃度ICCM時5. 10Gy ICCM明顯下調(diào)ALP活性；20%濃度ICCM時各照射劑量組ICCM均顯著抑制ALP活性。ICCM對OB的體外礦化結(jié)節(jié)形成能力也呈明顯抑制作用,加入2,5,10Gy的ICCM培養(yǎng)后細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)面積分別減少33.9%,42.1%和50.8%(p0.05)。此外,20%濃度ICCM培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因ALP、OC、OPG mRNA表達(dá)也出現(xiàn)不同程度下調(diào)。2.共培養(yǎng)體系中未受照成骨細(xì)胞的增殖分化能力在2h就有明顯下降(p0.05)。與對照組比較,與不同劑量受照OB共培養(yǎng)可使未受照OB的增殖和分化能力均呈不同程度降低,礦化結(jié)節(jié)面積在1Gy和2Gy時即明顯減少。此外,共培養(yǎng)體系中OB相關(guān)基因ALP、OC、OPG mRNA表達(dá)較對照組明顯降低(p0.001), RANKL/OPG比值升高；caspase3基因表達(dá)上調(diào),在5Gy和10Gy劑量時有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。同時,隨著照射劑量增大,ALP蛋白表達(dá)下調(diào)、caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)(p0.05),并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。3.受照NRK-52E細(xì)胞條件培養(yǎng)基對未受照成骨細(xì)胞增殖、ALP有一定影響作用。10%濃度ICCM作用時,10Gy照射組的NRK-52E細(xì)胞ICCM可引起未受照OB的增殖能力明顯抑制；20%濃度ICCM作用時,不同劑量組的NRK-52E細(xì)胞ICCM對未受照OB的增殖和ALP活性均有不同程度抑制,且在10Gy和15Gy時抑制明顯,有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。進(jìn)一步應(yīng)用建立的成骨細(xì)胞-腎小管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系觀察了其時間-效應(yīng),表明經(jīng)5Gyγ射線照射后72h的NRK-52E細(xì)胞共培養(yǎng),未受照成骨細(xì)胞的增殖、ALP活性均表現(xiàn)出明顯抑制(F=14.212,p0.01)。劑量-效應(yīng)研究進(jìn)一步證明,受照后的腎小管上皮細(xì)胞與未受照成骨細(xì)胞共培養(yǎng)可導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖和ALP活性下降,且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中,ALP活性降低在1,5,10Gy照射劑量時有統(tǒng)計學(xué)意義。[研究結(jié)論]1.采用細(xì)胞條件培養(yǎng)基方法和成骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,證明了受照自體細(xì)胞對未受照成骨細(xì)胞生物學(xué)功能如增殖、分化和礦化,以及骨代謝相關(guān)基因和蛋白表達(dá)具有直接調(diào)節(jié)作用,并可引起未受照成骨細(xì)胞凋亡。成骨細(xì)胞受照后產(chǎn)生的某些細(xì)胞因子可能與電離輻射的非靶效應(yīng)相關(guān)。2.受照后腎小管上皮細(xì)胞對未受照成骨細(xì)胞也具有直接調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步證明了電離輻射致骨損傷遠(yuǎn)端效應(yīng)的影響,初步揭示了癌癥放療引起的骨量丟失中腎-骨作用模式的可能。3.建立了腎小管上皮細(xì)胞-成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系,可用于進(jìn)一步開展電離輻射致骨損傷遠(yuǎn)端效應(yīng)包括腎-骨作用通路的細(xì)胞分子機(jī)制研究
【關(guān)鍵詞】：遠(yuǎn)端效應(yīng) 放射治療 成骨細(xì)胞 條件培養(yǎng)基 電離輻射 共培養(yǎng) Transwell板 腎小管上皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R730.55
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 受照自體細(xì)胞條件培養(yǎng)基對成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響12-31
• 引言12
• 材料與試劑12-14
• 方法14-19
• 結(jié)果19-28
• 討論28-30
• 小結(jié)30-31
• 第二部分 受照自體細(xì)胞對共培養(yǎng)成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響31-43
• 引言31
• 材料與試劑31-32
• 方法32-36
• 結(jié)果36-41
• 討論41-42
• 小結(jié)42-43
• 第三部分 受照腎小管上皮細(xì)胞對共培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖和分化能力的影響43-53
• 引言43
• 材料與試劑43-44
• 方法44-46
• 結(jié)果46-50
• 討論50-52
• 小結(jié)52-53
• 全文小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 綜述 電離輻射遠(yuǎn)端效應(yīng)研究現(xiàn)狀60-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68
• 附錄 在校期間參加學(xué)術(shù)會議、發(fā)表學(xué)術(shù)論文及獲獎情況68-69
• 主要試劑配制69-70
• 英文縮略詞表70-71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 高林峰;王洪復(fù);;電離輻射所致腎損傷引起的骨代謝異常的機(jī)制探討[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報;2006年05期

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本文編號：990374