發(fā)布時(shí)間：2017-09-19 06:12

  本文關(guān)鍵詞：受照角質(zhì)細(xì)胞HaCat產(chǎn)生電離輻射旁效應(yīng)信號(hào)機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:電離輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)被定義為受照射細(xì)胞傳遞信號(hào)給周圍未受照射的細(xì)胞從而導(dǎo)致后者出現(xiàn)的生物學(xué)變化。盡管旁效應(yīng)的概念已被廣泛接受,并且被認(rèn)為可能在輻射致癌和放療的療效及副作用等方面發(fā)揮重要作用,但其發(fā)生的具體分子機(jī)制仍不明確。旁效應(yīng)的產(chǎn)生需要兩個(gè)細(xì)胞群,即受照細(xì)胞和未受照旁效應(yīng)細(xì)胞。本課題的主要目的是從受照細(xì)胞的角度出發(fā),來(lái)研究旁效應(yīng)發(fā)生的分子機(jī)制并在構(gòu)建的體系中探究旁效應(yīng)的后果。首先在Ha Cat角質(zhì)細(xì)胞中觀察X射線是否能在同種細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng),并對(duì)其可能機(jī)制做初步研究,在此工作的基礎(chǔ)上,在以角質(zhì)細(xì)胞Ha Cat和成纖維細(xì)胞WS1構(gòu)建的二維培養(yǎng)模型中觀察X射線和α粒子能否誘導(dǎo)旁效應(yīng)的產(chǎn)生,研究旁效應(yīng)的發(fā)生是否與射線品質(zhì)相關(guān),并進(jìn)一步研究其相關(guān)機(jī)制,然后,對(duì)旁效應(yīng)產(chǎn)生的后果進(jìn)行研究,以細(xì)胞遷移能力為指標(biāo)觀察受照射角質(zhì)細(xì)胞對(duì)未受照射角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞遷移能力的影響,最后,完成皮膚三維培養(yǎng)模型的初步構(gòu)建,以期下一步在更接近機(jī)體正常環(huán)境的體系中研究旁效應(yīng)。方法:首先采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移及二維共培養(yǎng)的方法,以微核(MN)、53BP1 foci、細(xì)胞增殖能力為生物學(xué)終點(diǎn),檢測(cè)X射線在角質(zhì)細(xì)胞Ha Cat同種細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)。用ELASA試劑盒檢測(cè)條件培養(yǎng)液中TGF-β1的含量,用ROS試劑盒檢測(cè)受到條件培養(yǎng)液培養(yǎng)后的未受照射角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。然后采用二維共培養(yǎng)的方法,以MN形成為指標(biāo),觀察角質(zhì)細(xì)胞Ha Cat在分別經(jīng)X射線、α粒子照射后能否在未受照射的成纖維細(xì)胞WS1中誘導(dǎo)旁效應(yīng)的產(chǎn)生,探究該體系中旁效應(yīng)的發(fā)生是否與射線品質(zhì)有關(guān)。用TGF-β1受體激酶抑制劑SB431542抑制角質(zhì)細(xì)胞Ha Cat內(nèi)TGF-β1信號(hào)通路后,觀察α粒子誘導(dǎo)的旁效應(yīng)是否改變。用PCR檢測(cè)受照射Ha Cat細(xì)胞內(nèi)mi R-21的水平,然后觀察經(jīng)轉(zhuǎn)染而過(guò)表達(dá)mi R-21水平的細(xì)胞受α粒子照射后誘導(dǎo)的旁效應(yīng)MN是否發(fā)生變化,觀察降低表達(dá)mi R-21水平的細(xì)胞是否能在與之共培養(yǎng)的WS1細(xì)胞中誘導(dǎo)類似旁效應(yīng)MN的產(chǎn)生。用Western Blot檢測(cè)經(jīng)X射線或α粒子照射后的角質(zhì)細(xì)胞Ha Cat內(nèi)TGF-β1/Smad2信號(hào)通路激活情況,觀察加入SB431542或者過(guò)表達(dá)該細(xì)胞mi R-21水平后是否降低α粒子誘導(dǎo)的Smad2的磷酸化水平,觀察降低mi R-21表達(dá)水平后該通路的激活情況。用PCR檢測(cè)經(jīng)SB431542預(yù)處理再經(jīng)α粒子照射后的Ha Cat細(xì)胞內(nèi)mi R-21水平。觀察經(jīng)α粒子或X射線照射后的Ha Cat細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。采用同種細(xì)胞及異種細(xì)胞構(gòu)建二維培養(yǎng)模型的方法,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察受α粒子照射后的Ha Cat細(xì)胞分別對(duì)未受照射角質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力的影響。最后,以鼠尾膠原蛋白為基質(zhì),用角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)建三維皮膚組織培養(yǎng)模型。結(jié)果:1、相對(duì)于相應(yīng)對(duì)照組,經(jīng)3 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h及48 h后未受照射Ha Cat細(xì)胞MN形成率分別增加了28%和58%;經(jīng)該條件培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后,未受照射Ha Cat細(xì)胞53BP1 foci陽(yáng)性細(xì)胞率增加了44%;經(jīng)該條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,未受照射Ha Cat細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯變化。相對(duì)于新鮮培養(yǎng)液而言,3 h條件培養(yǎng)液中TGF-β1含量無(wú)明顯變化。相對(duì)于新鮮培養(yǎng)液組,經(jīng)3 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后,未受照射Ha Cat細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加了33%;但相對(duì)于相應(yīng)對(duì)照組,經(jīng)3 h條件培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后,未受照射Ha Cat細(xì)胞內(nèi)ROS水平無(wú)明顯變化。與受照細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,未受照射Ha Cat細(xì)胞微核形成率增加了54%;與受照細(xì)胞共培養(yǎng)1 h,未受照射Ha Cat細(xì)胞53BP1 foci陽(yáng)性細(xì)胞率增加了35%。2、I.在以角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)建的二維培養(yǎng)模型中,以MN為指標(biāo),與對(duì)照組相比,發(fā)現(xiàn)未受照射的WS1細(xì)胞在與受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后MN形成率增加了53%,而X射線(1、2、5、10 Gy)均不能誘導(dǎo)該現(xiàn)象的發(fā)生。但這種現(xiàn)象并非因?yàn)閄射線造成的損傷小,事實(shí)上,2-10 Gy的X射線在Ha Cat細(xì)胞中造成的MN形成率和細(xì)胞致死率都高于0.56 Gy的α粒子。II.在該模型中,在照前用SB431542預(yù)處理Ha Cat細(xì)胞使得α粒子誘導(dǎo)的旁效應(yīng)微核降至本底水平。III.α粒子(0.56 Gy)照射后Ha Cat細(xì)胞內(nèi)Smad2磷酸化水平立即增高,于1 h達(dá)到高峰,并一直持續(xù)至少兩個(gè)小時(shí),而經(jīng)X(1 Gy)射線照射后0 h、0.5 h、1 h、2 h Smad2磷酸化水平均無(wú)變化,加大X射線劑量至2、5、10 Gy同樣不會(huì)增加Smad2磷酸化水平。IV.用10μM SB431542預(yù)處理Ha Cat細(xì)胞1 h,再用α粒子(0.56 Gy)照射,發(fā)現(xiàn)照射后1 h Smad2磷酸化水平在原有增加的基礎(chǔ)上明顯降低了。V.PCR結(jié)果顯示信號(hào)細(xì)胞Ha Cat經(jīng)α粒子(0.56 Gy)照射后1 h,mi R-21水平下降了1.6倍,3 h后mi R-21水平下降了1.2倍;經(jīng)X射線(1 Gy)照射后1 h,mi R-21水平下降了1.4倍,3 h后卻升高了1.7倍。在此結(jié)果基礎(chǔ)上,過(guò)表達(dá)信號(hào)細(xì)胞中mi R-21使得α粒子誘導(dǎo)的旁效應(yīng)MN降至本底水平,而僅僅降低信號(hào)細(xì)胞中mi R-21的表達(dá)就可以在與之共培養(yǎng)的WS1細(xì)胞中誘導(dǎo)類似旁效應(yīng)的MN的產(chǎn)生。VI.信號(hào)細(xì)胞Ha Cat用10μM SB431542預(yù)處理1 h,再經(jīng)0.56 Gyα粒子照射,照后1 h組mi R-21的下降水平由原來(lái)的1.6倍變?yōu)?.2倍,而3 h組則由原來(lái)的下降轉(zhuǎn)為升高。VII.過(guò)表達(dá)Ha Cat信號(hào)細(xì)胞的mi R-21水平,再用0.56 Gyα粒子照射后,與相應(yīng)對(duì)照組相比其Smad2的磷酸化水平降低。而當(dāng)先降低Ha Cat信號(hào)細(xì)胞的mi R-21表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,即使不加照射,也會(huì)激活TGF-β1/Smad2信號(hào)通路。VIII.α粒子(0.56 Gy)照射后5 h使得信號(hào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加了25%,X射線(1 Gy)照射使得細(xì)胞內(nèi)ROS水平僅僅增加了3%。3、未受照射Ha Cat細(xì)胞在與受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat細(xì)胞共培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后細(xì)胞遷移能力明顯增加,未受照射WS1細(xì)胞在與受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat細(xì)胞共培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后胞遷移能力明顯減慢。4、成功完成了三維皮膚組織模型的構(gòu)建。結(jié)論:1、X射線可以在角質(zhì)細(xì)胞同種細(xì)胞間誘導(dǎo)旁效應(yīng)的產(chǎn)生。2、在以角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)建的二維培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)α粒子照射后可以誘導(dǎo)旁效應(yīng)的產(chǎn)生,而X射線不能誘導(dǎo)旁效應(yīng)的產(chǎn)生,顯示旁效應(yīng)的產(chǎn)生與射線品質(zhì)相關(guān)。3、在異種細(xì)胞二維培養(yǎng)模型中,α粒子誘導(dǎo)的旁效應(yīng)與受照Ha Cat細(xì)胞中TGF-β1/Smad2信號(hào)通路的激活和mi R-21的持續(xù)降低有關(guān),并且TGF-β1/Smad2信號(hào)通路和mi R-21之間存在互相調(diào)控的作用。4、直接受照射角質(zhì)細(xì)胞可以加快未受照射角質(zhì)細(xì)胞的遷移速度,減慢未受受照射成纖維細(xì)胞的遷移速度。
【關(guān)鍵詞】：電離輻射旁效應(yīng) 成纖維細(xì)胞 角質(zhì)細(xì)胞 α粒子 TGF-β1/Smad2信號(hào)通路 mi R-21 MN
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R818
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 引言14-18
• 第一章X射線在HaCat細(xì)胞中誘導(dǎo)旁效應(yīng)現(xiàn)象的研究18-31
• 1 材料和儀器18-20
• 2 實(shí)驗(yàn)方法20-24
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-29
• 4 討論29-31
• 第二章 旁效應(yīng)與射線品質(zhì)相關(guān)性的研究31-40
• 1 材料和儀器31-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-36
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-39
• 4 討論39-40
• 第三章 旁效應(yīng)與射線品質(zhì)相關(guān)性機(jī)制的研究40-60
• 1 材料和儀器41-42
• 2 實(shí)驗(yàn)方法42-45
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-55
• 4 討論55-60
• 第四章 旁效應(yīng)現(xiàn)象后果的研究60-65
• 1 材料和儀器60-61
• 2 實(shí)驗(yàn)方法61-62
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-64
• 4 討論64-65
• 第五章 三維皮膚培養(yǎng)模型的構(gòu)建65-71
• 1 材料和儀器65-66
• 2 實(shí)驗(yàn)方法66-69
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-70
• 4 討論70-71
• 結(jié)論與展望71-73
• 參考文獻(xiàn)73-81
• 綜述81-88
• 參考文獻(xiàn)85-88
• 攻讀學(xué)位期間本人出版或公開發(fā)表的論文88-89
• 參與的科研項(xiàng)目89-90
• 縮略詞表90-91
• 致謝91-92

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