本文關(guān)鍵詞：3-甲基腺嘌呤及SIK2對(duì)放射誘發(fā)細(xì)胞自噬的影響研究

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【摘要】：目的:研究PI3K抑制劑3-MA、SIK2以及分割照射對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞自噬的影響,探索SIK2在電離輻射誘發(fā)細(xì)胞自噬中的作用。探討3-MA在細(xì)胞照射后對(duì)細(xì)胞自噬及凋亡發(fā)生的影響,并觀察照射的生物效應(yīng)時(shí)效規(guī)律,為闡明電離輻射誘發(fā)細(xì)胞自噬的機(jī)制提供新的依據(jù)。方法:1.4 Gy 60Coγ、3-MA早期作用(即在照射后即刻時(shí)間點(diǎn)加入3-MA并作用12 h)和3-MA后期作用(即在照射后12 h加入3-MA并作用12 h)于sh RNA介導(dǎo)SIK2敲低的Hela-sh SIK2及其對(duì)照細(xì)胞后,于0 h,12 h,24 h,48 h和72 h用CCK8檢測(cè)不同處理后細(xì)胞的增殖和毒性效應(yīng)。2.4 Gy 60Coγ、3-MA早期作用和3-MA后期作用于Hela-sh SIK2及其對(duì)照細(xì)胞,Annexin V-FITC/PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3.2 Gy、4 h分割照射劑量(2+2 Gy)和單劑量4 Gy X射線照射以及3-MA早期作用于Hela-sh SIK2及其對(duì)照細(xì)胞,克隆形成率檢測(cè)細(xì)胞的放射敏感性。4.2 Gy、4 h分割照射劑量(2+2 Gy)和單劑量4 Gy X射線照射后,免疫印跡檢測(cè)LC3蛋白隨照射后時(shí)間表達(dá)水平的變化。5.2 Gy、4 h分割照射劑量(2+2 Gy)和單劑量4 Gy X射線照射轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的Hela-sh SIK2及其對(duì)照細(xì)胞,免疫熒光觀察自噬體的形成。結(jié)果:1.CCK8結(jié)果顯示各處理組和對(duì)照組相比,在12 h內(nèi)3-MA晚期作用組無(wú)明顯影響,其余處理組在12 h時(shí)即發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性,P0.05;以4 Gy照射組為對(duì)照組,照射聯(lián)合3-MA早期(照射后即刻至12 h)處理組在12 h,24 h,48 h,72 h產(chǎn)生更大的毒性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01;以4 Gy照射組為對(duì)照組,照射聯(lián)合3-MA后期(照射后12 h至24 h)處理組在24 h、48 h和72 h產(chǎn)生更大的毒性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。2.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋亡發(fā)現(xiàn)以0 h為對(duì)照組,各處理組的凋亡率增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01;以4 Gy照射組為對(duì)照,照射聯(lián)合3-MA早期作用組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。以照射聯(lián)合3-MA早期作用組為對(duì)照,3-MA后期作用組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。3.克隆形成率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3-MA聯(lián)合2+2 Gy照射組與3-MA聯(lián)合4 Gy照射組相比較,細(xì)胞存活率高,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;各劑量組加入3-MA前期作用后存活率明顯降低,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。Hela-sh SIK2細(xì)胞3-MA聯(lián)合照射組與對(duì)照組Hela-sh NC細(xì)胞對(duì)放射更加敏感,細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。4.Western Blot結(jié)果表明,在對(duì)照細(xì)胞中三種劑量下都能引起LC3II的增多,并在24 h達(dá)到高峰。不同劑量同一時(shí)間LC3II表達(dá)情況,分割照射2+2 Gy LC3II的表達(dá)水平比單次4 Gy照射高,說(shuō)明分割照射似乎增強(qiáng)了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬;而在敲低細(xì)胞中,LC3II的表達(dá)水平比對(duì)照細(xì)胞低,說(shuō)明SIK2敲低細(xì)胞減弱了細(xì)胞自噬。5.免疫熒光可看出SIK2敲低的細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3的熒光強(qiáng)度不及對(duì)照組。更有效的證實(shí)了SIK2對(duì)電離輻射后細(xì)胞自吞噬的負(fù)調(diào)控。且分割照射劑量2+2 Gy的熒光強(qiáng)度比其他照射組同一時(shí)間的熒光強(qiáng)度強(qiáng)。結(jié)論:3-MA早期作用和3-MA晚期作用對(duì)細(xì)胞毒性存在差異,3-MA早期作用對(duì)細(xì)胞毒性更大。3-MA早期作用比3-MA晚期作用更能促進(jìn)凋亡,差異有顯著性。分割照射劑量比單劑量照射下LC3Ⅱ的表達(dá)更多,更有利于自噬的發(fā)生。SIK2敲低后減弱了輻射誘發(fā)的細(xì)胞自吞噬作用,細(xì)胞的放射敏感性增加。
【關(guān)鍵詞】：鹽誘導(dǎo)激酶2(SIK2) 3-MA 電離輻射 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞自噬 放射敏感性 分割劑量照射
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R818
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 主要英文縮略語(yǔ)索引10-11
• 第1章 緒論11-15
• 第2章 材料與方法15-31
• 2.1 材料15-17
• 2.2 方法17-31
• 第3章 結(jié)果31-39
• 3.1 SIK2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響31
• 3.2 γ 放射照射后不同時(shí)間3甲基腺嘌呤對(duì)He La細(xì)胞放射敏感性的影響31-33
• 3.3 3-MA不同時(shí)間作用對(duì)受照射細(xì)胞凋亡的促進(jìn)程度33-35
• 3.4 分割照射劑量下細(xì)胞的放射敏感性35-36
• 3.5 檢測(cè)分割照射下SIK2敲低細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)36-37
• 3.6 免疫熒光檢測(cè)分割照射劑量下自噬體的形成37-39
• 第4章 討論39-43
• 第5章 結(jié)論43-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述49-63
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果63-65
• 致謝65

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